背景由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）严重影响了人民健康生活和经济发展。除疫苗接种外,通过病毒检测实现早发现早隔离仍是疫情防控的重点。虽然核酸检测方法仍是SARS-CoV-2感染准确诊断的“金标准”,但该技术对检测要求较为严格,无法满足居家自我检测及快速检测需求。基于侧向层析技术的抗原检测方法可直接对SARS-CoV-2蛋白进行测定,检测时间短,无需专业人员操作,可作为核酸检测的有效补充手段。目的本研究旨在建立一种新型冠状病毒抗原荧光免疫层析定量检测方法,为新冠肺炎患者提供即时、快速、准确的辅助诊断。方法1.新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备:利用实验室构建的NP工程菌自制重组核衣壳蛋白（Nucleocapsid,N蛋白,NP）进行小鼠免疫,待血清效价达到要求时,采用杂交瘤技术制备新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对N蛋白单克隆抗体纯度进行鉴定、Western Blot鉴定其对NP的反应性。同时通过ELISA方法筛选出最佳配对单克隆抗体。2.参考品制备:经BCA蛋白浓度测定试剂盒对NP进行反复标定,制备一套NP室内参考品。3.新型冠状病毒抗原荧光层析定量检测方法的初步建立:采用时间分辨荧光微球对NP单克隆抗体、兔lgG多克隆抗体进行标记,以硝酸纤维素（NC）膜为载体对配对NP单克隆抗体、羊抗兔lgG多克隆抗体进行包被,基于双抗体夹心法原理,研制试纸条。4.工艺优化及性能评价:对荧光微球、玻璃纤维棉、NC膜三种主要原材料进行筛选,缓冲液类型、活化方式、标记抗体量等条件进行优化;同时采用优化后的工艺制备试纸条,并通过线性范围、最低检出限、精密度、特异性、稳定性等方面对试纸条进行性能评价,与广州万孚新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法）进行方法学比对。结果1.本研究制备出4株NP单克隆抗体,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量大小均在160kDa左右,与理论值一致,纯度较好;Western Blot证实其对NP具有良好的反应性。经ELISA方法确定M-6C8作为标记抗体、M-1C5作为包被抗体。2.制备了一套线性参考品以及精密性参考品。3.初步建立了新型冠状病毒抗原荧光免疫层析定量检测方法,研制出试纸条。4.筛选出最适的荧光层析用原材料,经工艺优化后,确定MES为最适缓冲体系,EDC-NHS两步法进行活化,最佳标记抗体量40 μg等;试纸条线性范围为200 pg/mL-25 ng/mL;最低检出限为91.95 pg/mL;批内、批间变异系数均小于15%;与甲乙流感病毒等六种呼吸道病毒无交叉反应;试纸条37℃加速破坏21天,荧光信号强度、T/C值变化范围在15%以内;与广州万孚新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法）平行检测NP蛋白及148份正常人咽拭子,荧光免疫层析法、胶体金法特异度分别可达到98.6%、99.3%,功能灵敏度分别可达到 100pg/mL、200pg/mL。结论1.成功制备并筛选出可用于新冠抗原荧光层析检测方法的最佳配对单克隆抗体。2.制备出一套用于新型冠状病毒抗原检测的室内参考品。3.建立了新型冠状病毒抗原荧光免疫层析定量检测方法。