论文部分内容阅读
目的：
膀胱癌是全球第十大最常见的癌症。约75%的患者在一开始被诊断为非肌肉侵袭型疾病，其余约25%的患者被诊断为肌肉侵袭型膀胱癌（MIBC）。大多数非肌肉侵袭型膀胱癌患者经尿道电切术（TURBT），辅以膀胱化疗或免疫治疗，5年生存率约为95%。但是，其中有70％的患者在初次治疗后会复发，30％的患者会发展成MIBC。MIBC的恶性度与转移率更高，具有高致死性。因膀胱癌死亡的患者所患的类型近乎全部为肌肉侵袭型膀胱癌，因此，了解膀胱癌侵袭的分子机制至关重要。
ChlA-F是一种新型的抗肿瘤化合物，团队前期研究发现ChlA-F通过激活Sp1依赖的转录和抑制miR-27a介导的mRNA降解来上调SESN2，在人膀胱癌细胞中诱导了自噬依赖性的抗癌作用。
SOX2是一个转录因子，也是一个必需的胚胎干细胞基因。直到最近，SOX2的研究重点才从胚胎发育转移到SOX2在疾病中的功能，尤其是，SOX2在癌症中的作用。但目前为止，尚未研究过SOX2在膀胱癌细胞侵袭中的潜在作用。
当前的研究旨在探索ChlA-F对膀胱癌细胞侵袭的影响，并阐明该作用的分子机制。
方法：
1、免疫组织化学（IHC）染色检查BBN诱导的小鼠膀胱癌组织中SOX2蛋白的表达水平。
2、Western blot检测小鼠膀胱组织中SOX2蛋白的表达以及ChlA-F处理后细胞中蛋白表达。
3、Kaplan-Meier Plotter在线工具分析TCGA数据库中与SOX2表达相关的膀胱癌患者生存曲线。
4、Transwell功能实验评估稳定转染细胞株中ChlA-F处理前后细胞迁移和侵袭能力。
5、35S蛋白翻译实验检测ChlA-F处理前后新合成的SOX2蛋白表达情况。
6、双荧光素酶报告基因实验检测SOX2mRNA3’-UTR以及miR-200c promoter的相对活性。
7、实时荧光定量PCR（qPCR）检测miRNAs以及mRNA的表达水平。
8、生物信息学分析SOX2mRNA3’-UTR上结合的miRNAs以及miR-200c promoter上结合的转录因子。
9、RNA-IP实验证明HuR与USP8mRNA的直接结合作用。
结果：
1、ChlA-F处理显著抑制高侵袭性膀胱癌细胞的侵袭能力
1.1、Transwell实验结果表明，ChlA-F处理后，T24T和U5637两种细胞中细胞侵袭能力均显著降低，而相同实验条件下细胞的迁移能力却并未受到明显影响，表明ChlA-F处理可特异性降低膀胱癌细胞的侵袭能力。
2、SOX2在高级别膀胱癌患者组织中高表达，且与不良预后呈正相关。
2.1、对比分析TCGA数据库中20例低级别（Low-Grade）与374例高级别（High-Grade）膀胱癌标本中SOX2的表达，结果发现SOX2在高级别膀胱癌组织中的表达明显高于低级别组。
2.2、Kaplan-Meier Plotter在线工具分析了TCGA数据库中的膀胱癌数据，发现SOX2高表达的膀胱癌患者的总体生存期比SOX2低表达的患者低。
3、SOX2在BBN诱导的小鼠膀胱癌组织中表达升高。
3.1、IHC结果显示随着BBN处理时间的增加，小鼠膀胱组织中SOX2蛋白水平逐渐升高，并在处理20周时达到最高。
3.2、Western blot检测了小鼠膀胱组织中SOX2蛋白的表达。BBN处理组的小鼠膀胱组织中SOX2蛋白表达水平明显高于对照组。
4、ChlA-F通过下调SOX2表达来抑制膀胱癌细胞侵袭。
4.1、ChlA-F处理显著抑制T24T和U5637细胞中外源性和内源性SOX2蛋白的表达。
4.2、ChlA-F在T24T(Vector)和T24T(SOX2)、U5637(Vector)和U5637(SOX2)细胞中均能显著抑制细胞侵袭，但对细胞迁移无明显影响。
4.3、敲除SOX2可以模拟ChlA-F对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用。
5、ChlA-F在蛋白翻译和降解水平共同抑制SOX2蛋白表达。
5.1、ChlA-F处理不影响T24T和U5637细胞中的SOX2mRNA的表达。
5.2、ChlA-F显著抑制SOX2蛋白的合成。
5.3、ChlA-F促进SOX2蛋白的降解。
6、ChlA-F诱导miR-200c表达，从而抑制SOX2mRNA3-UTR活性。
6.1、ChlA-F处理导致T24T和U5637细胞中SOX2mRNA3-UTR活性均呈剂量依赖性降低。
6.2、ChlA-F处理可特异性诱导miR-200c和miR-145的表达，随后通过功能获得和功能丧失实验排除了miR-145抑制SOX2蛋白翻译的可能。
6.3、miR-200c过表达、沉默以及miR-200c结合位点的突变共同证实了miR-200c在ChlA-F抑制SOX2蛋白翻译中的关键作用。
7、JNK/c-Jun途径激活负责ChlA-F介导的miR-200c转录。
7.1、ChlA-F处理导致miR-200c启动子转录以剂量依赖性方式显著增加。
7.2、JNK/c-Jun活化参与了ChlA-F处理后miR-200c启动子转录活性的增加。
8、ChlA-F通过增加USP8蛋白表达在蛋白降解水平下调SOX2表达。
8.1、ChlA-F介导的SOX2蛋白降解通过泛素-蛋白酶体途径发生。
8.2、ChlA-F处理后，USP8mRNA和蛋白表达明显上调。
8.3、敲减USP8减缓了ChlA-F诱导的SOX2蛋白降解速率，并减弱了ChlA-F对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用。
9、ChlA-F增加HuR蛋白表达以增强USP8mRNA的稳定性。
9.1、ChlA-F正向促进USP8mRNA的稳定性。
9.2、ChlA-F处理导致HuR蛋白以剂量依赖性方式积累。
9.3、敲减HuR削弱了T24T细胞中ChlA-F对USP8mRNA和蛋白质表达的上调作用，并逆转了ChlA-F诱导的SOX2表达的下调。
9.4、RNA-IP分析表明，HuR能与USP8mRNA特异性结合。
结论：
本研究发现SOX2在BBN诱导的小鼠膀胱癌组织中高表达，且SOX2高表达的临床膀胱癌患者预后较差。而新型抗癌化合物ChlA-F可以显著降低人高级侵袭型膀胱癌细胞中SOX2蛋白的表达，进而抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。机制研究表明ChlA-F在蛋白质降解和蛋白质翻译水平上共同下调SOX2蛋白表达。更深层次的机制研究发现，一方面，ChlA-F处理显著增加了c-Jun Ser63和Ser73位的磷酸化，启动miR-200c转录。增加的miR-200c直接与SOX2mRNA3-UTR结合，从而抑制SOX2蛋白的翻译。另一方面，ChlA-F处理诱导HuR蛋白表达，且增加的HuR与USP8mRNA相互结合，导致USP8mRNA稳定性和蛋白表达升高。升高的USP8随后会促进SOX2蛋白降解。本研究为理解ChlA-F处理对SOX2的抑制作用提供了新的机制见解，为进一步探索ChlA-F作为治疗高侵袭性/转移性人膀胱癌患者的一种新的治疗化合物提供了重要信息。
膀胱癌是全球第十大最常见的癌症。约75%的患者在一开始被诊断为非肌肉侵袭型疾病，其余约25%的患者被诊断为肌肉侵袭型膀胱癌（MIBC）。大多数非肌肉侵袭型膀胱癌患者经尿道电切术（TURBT），辅以膀胱化疗或免疫治疗，5年生存率约为95%。但是，其中有70％的患者在初次治疗后会复发，30％的患者会发展成MIBC。MIBC的恶性度与转移率更高，具有高致死性。因膀胱癌死亡的患者所患的类型近乎全部为肌肉侵袭型膀胱癌，因此，了解膀胱癌侵袭的分子机制至关重要。
ChlA-F是一种新型的抗肿瘤化合物，团队前期研究发现ChlA-F通过激活Sp1依赖的转录和抑制miR-27a介导的mRNA降解来上调SESN2，在人膀胱癌细胞中诱导了自噬依赖性的抗癌作用。
SOX2是一个转录因子，也是一个必需的胚胎干细胞基因。直到最近，SOX2的研究重点才从胚胎发育转移到SOX2在疾病中的功能，尤其是，SOX2在癌症中的作用。但目前为止，尚未研究过SOX2在膀胱癌细胞侵袭中的潜在作用。
当前的研究旨在探索ChlA-F对膀胱癌细胞侵袭的影响，并阐明该作用的分子机制。
方法：
1、免疫组织化学（IHC）染色检查BBN诱导的小鼠膀胱癌组织中SOX2蛋白的表达水平。
2、Western blot检测小鼠膀胱组织中SOX2蛋白的表达以及ChlA-F处理后细胞中蛋白表达。
3、Kaplan-Meier Plotter在线工具分析TCGA数据库中与SOX2表达相关的膀胱癌患者生存曲线。
4、Transwell功能实验评估稳定转染细胞株中ChlA-F处理前后细胞迁移和侵袭能力。
5、35S蛋白翻译实验检测ChlA-F处理前后新合成的SOX2蛋白表达情况。
6、双荧光素酶报告基因实验检测SOX2mRNA3’-UTR以及miR-200c promoter的相对活性。
7、实时荧光定量PCR（qPCR）检测miRNAs以及mRNA的表达水平。
8、生物信息学分析SOX2mRNA3’-UTR上结合的miRNAs以及miR-200c promoter上结合的转录因子。
9、RNA-IP实验证明HuR与USP8mRNA的直接结合作用。
结果：
1、ChlA-F处理显著抑制高侵袭性膀胱癌细胞的侵袭能力
1.1、Transwell实验结果表明，ChlA-F处理后，T24T和U5637两种细胞中细胞侵袭能力均显著降低，而相同实验条件下细胞的迁移能力却并未受到明显影响，表明ChlA-F处理可特异性降低膀胱癌细胞的侵袭能力。
2、SOX2在高级别膀胱癌患者组织中高表达，且与不良预后呈正相关。
2.1、对比分析TCGA数据库中20例低级别（Low-Grade）与374例高级别（High-Grade）膀胱癌标本中SOX2的表达，结果发现SOX2在高级别膀胱癌组织中的表达明显高于低级别组。
2.2、Kaplan-Meier Plotter在线工具分析了TCGA数据库中的膀胱癌数据，发现SOX2高表达的膀胱癌患者的总体生存期比SOX2低表达的患者低。
3、SOX2在BBN诱导的小鼠膀胱癌组织中表达升高。
3.1、IHC结果显示随着BBN处理时间的增加，小鼠膀胱组织中SOX2蛋白水平逐渐升高，并在处理20周时达到最高。
3.2、Western blot检测了小鼠膀胱组织中SOX2蛋白的表达。BBN处理组的小鼠膀胱组织中SOX2蛋白表达水平明显高于对照组。
4、ChlA-F通过下调SOX2表达来抑制膀胱癌细胞侵袭。
4.1、ChlA-F处理显著抑制T24T和U5637细胞中外源性和内源性SOX2蛋白的表达。
4.2、ChlA-F在T24T(Vector)和T24T(SOX2)、U5637(Vector)和U5637(SOX2)细胞中均能显著抑制细胞侵袭，但对细胞迁移无明显影响。
4.3、敲除SOX2可以模拟ChlA-F对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用。
5、ChlA-F在蛋白翻译和降解水平共同抑制SOX2蛋白表达。
5.1、ChlA-F处理不影响T24T和U5637细胞中的SOX2mRNA的表达。
5.2、ChlA-F显著抑制SOX2蛋白的合成。
5.3、ChlA-F促进SOX2蛋白的降解。
6、ChlA-F诱导miR-200c表达，从而抑制SOX2mRNA3-UTR活性。
6.1、ChlA-F处理导致T24T和U5637细胞中SOX2mRNA3-UTR活性均呈剂量依赖性降低。
6.2、ChlA-F处理可特异性诱导miR-200c和miR-145的表达，随后通过功能获得和功能丧失实验排除了miR-145抑制SOX2蛋白翻译的可能。
6.3、miR-200c过表达、沉默以及miR-200c结合位点的突变共同证实了miR-200c在ChlA-F抑制SOX2蛋白翻译中的关键作用。
7、JNK/c-Jun途径激活负责ChlA-F介导的miR-200c转录。
7.1、ChlA-F处理导致miR-200c启动子转录以剂量依赖性方式显著增加。
7.2、JNK/c-Jun活化参与了ChlA-F处理后miR-200c启动子转录活性的增加。
8、ChlA-F通过增加USP8蛋白表达在蛋白降解水平下调SOX2表达。
8.1、ChlA-F介导的SOX2蛋白降解通过泛素-蛋白酶体途径发生。
8.2、ChlA-F处理后，USP8mRNA和蛋白表达明显上调。
8.3、敲减USP8减缓了ChlA-F诱导的SOX2蛋白降解速率，并减弱了ChlA-F对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用。
9、ChlA-F增加HuR蛋白表达以增强USP8mRNA的稳定性。
9.1、ChlA-F正向促进USP8mRNA的稳定性。
9.2、ChlA-F处理导致HuR蛋白以剂量依赖性方式积累。
9.3、敲减HuR削弱了T24T细胞中ChlA-F对USP8mRNA和蛋白质表达的上调作用，并逆转了ChlA-F诱导的SOX2表达的下调。
9.4、RNA-IP分析表明，HuR能与USP8mRNA特异性结合。
结论：
本研究发现SOX2在BBN诱导的小鼠膀胱癌组织中高表达，且SOX2高表达的临床膀胱癌患者预后较差。而新型抗癌化合物ChlA-F可以显著降低人高级侵袭型膀胱癌细胞中SOX2蛋白的表达，进而抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。机制研究表明ChlA-F在蛋白质降解和蛋白质翻译水平上共同下调SOX2蛋白表达。更深层次的机制研究发现，一方面，ChlA-F处理显著增加了c-Jun Ser63和Ser73位的磷酸化，启动miR-200c转录。增加的miR-200c直接与SOX2mRNA3-UTR结合，从而抑制SOX2蛋白的翻译。另一方面，ChlA-F处理诱导HuR蛋白表达，且增加的HuR与USP8mRNA相互结合，导致USP8mRNA稳定性和蛋白表达升高。升高的USP8随后会促进SOX2蛋白降解。本研究为理解ChlA-F处理对SOX2的抑制作用提供了新的机制见解，为进一步探索ChlA-F作为治疗高侵袭性/转移性人膀胱癌患者的一种新的治疗化合物提供了重要信息。