mmu-miR-206-3p通过靶向孤核受体Nurr1影响小鼠ADHD样行为的机制研究

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注意力缺陷多动障碍(Attention-deficit/hyperactivity disorder,ADHD)又称多动症,是一种常见的由儿童时期发病的神经发育障碍类疾病,其特征是多动、冲动和注意力不集中。目前临床诊断主要依赖行为评估,缺乏有效的分子诊断标记,儿童早期诊断仍面临很大的困难。阐明ADHD的发病机制对早期精确诊断与靶向治疗具有重要意义。研究发现多巴胺能神经递质系统在ADHD中起到关键的作用,多巴胺的功能异常可能是ADHD发病的重要原因之一。小鼠Per1突变体被认为是一个良好的ADHD动物模型。前期研究中,我们从Per1敲除小鼠大脑中筛选出一系列差异表达的microRNA,其中miR-206表达量明显增高。预测结果显示miR-206-3p靶向特异性调节多巴胺能神经元发育的关键因子Nurr1(Nuclear receptor related factor 1,Nr4a2)。Nurr1是胚胎发育过程中决定中脑多巴胺能神经元发育和维持的重要转录因子之一,在多巴胺能神经元的产生和存活中发挥重要的作用。有研究发现,Nurr1杂合突变小鼠表现出典型的ADHD表型。近年来,研究发现microRNA作为疾病诊断生物标志物具有很大的潜能,microRNA表达和功能失调与多种神经疾病的发病机制有关,在ADHD中也发现了多种microRNA的差异表达,而目前microRNA如何参与调控ADHD的研究鲜有报导。本研究以小鼠为研究对象,综合利用分子生物学及动物行为学研究方法,旨在探讨miR-206-3p在ADHD中的调控作用,为ADHD早期分子诊断提供理论依据。研究方法:(1)Per1敲除小鼠鼠脑microRNA深度测序寻找差异表达的microRNA,确定候选小分子RNA。(2)real-time PCR检测miR-206-3p在小鼠体内的表达谱及节律表达规律;分析miR-206-3p启动子功能,明确miR-206-3p节律调控的作用机制。(3)通过生物信息学数据库(TargetScan和miRDB)预测miR-206-3p的靶基因,分析筛选与神经发育相关的基因。(4)构建 Nurr1 3’UTR 和去除 miR-206-3p 识别位点的 Nurr1 mutant 3’UTR 荧光素酶报告质粒,用双荧光素酶实验验证miR-206-3p与Nurr1的相互作用。(5)在小鼠中脑多巴胺神经元细胞系MN9D中转染miR-206-3p mimics和inhibitor 来过表达和敲降 miR-206-3p,real-time PCR 和 western blot 检测Nurr1的mRNA和蛋白质表达水平。(6)构建腺相关病毒(AAV)对小鼠进行侧脑室注射,过表达或敲降miR-206-3p,用旷场实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫及宿主入侵等行为学试验评估自发活动、焦虑水平和学习等认知功能,用ELISA检测小鼠多巴胺的水平,确定miR-206-3p的功能。(7)取小鼠鼠脑进行RNA-seq,real-time PCR检测鼠脑中多巴胺代谢通路、神经元保护以及生物节律相关基因的表达。(8)ADHD临床治疗药物拯救miR-206-3p异常表达小鼠的表型。研究结果:(1)miR-206-3p在小鼠中脑内节律性表达,其表达峰值在ZT8,表达谷值在ZT24,并且miR-206-3p受到核心生物钟的调控。(2)miR-206-3p直接作用于Nurr1,在小鼠中脑多巴胺神经元细胞系MN9D中过表达/敲降miR-206-3p,Nurr1表达量明显降低/增高。(3)过表达miR-206-3p小鼠出现多动、冲动和攻击性强的表型,同时表现出焦虑的症状,血清多巴胺水平显著降低。(4)过表达miR-206-3p小鼠鼠脑中共有8个差异表达的基因定位到生物节律调控,GO分析结果显示多个上调基因所在通路跟神经系统发育及功能有关,数个下调基因所在通路跟酪氨酸代谢过程有关。(5)过表达miR-206-3p不影响多巴胺的合成,但是催化多巴胺代谢的酶Dbh和Mao表达量显著增加,并且多巴胺受体Drd2、Drd4表达显著降低。(6)ADHD临床治疗药物利他林以及Nurr1的激动剂5-氯吲哚均可以拯救过表达miR-206-3p小鼠的多动表型。(7)敲降miR-206-3p小鼠的活动量和焦虑水平与对照小鼠相比没有显著差异。结论:miR-206-3p受到核心生物钟的调控,通过负向调控Nurr1上调Mao和Dbh的表达,引起多巴胺含量下降,导致小鼠出现部分ADHD表型。miR-206-3p在ADHD中的调控作用对于ADHD早期临床诊断具有重要的理论和应用价值。
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