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[目的]
急性白血病是一类起源于造血干细胞病变的恶性克隆性疾病，虽然近年来以大剂量化疗为主的综合疗法的广泛应用，使其治疗效果有了明显提高，但仍然有相当一部分患者因疾病复发或耐药而转变成难治，因此积极寻求新的治疗方法，在当前仍然显得尤为必要。
中药厚朴属木兰科木兰属乔木植物，其树皮为我国传统中药材，和厚朴酚(honokiol，HNK)是其主要化学成分之一，属于联苯酚类化合物。现代医学发现和厚朴酚具有抗氧化、抗炎、抗焦虑、抗菌、抗血栓形成和抗肿瘤的作用。近年来体内外试验均证实和厚朴酚对多种实体肿瘤细胞有抑制作用，引起人们极大关注，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡，促进部分肿瘤细胞分化，抗肿瘤血管生成，和阻止肿瘤转移，逆转部分实体瘤耐药细胞的耐药性有关。
本实验拟观察和厚朴酚对人急性红白血病细胞株K562细胞的增殖、凋亡以及对凋亡相关基因表达的影响，为和厚朴酚治疗急性髓系白血病提供理论依据。
[方法]
(1)K562白血病细胞株的体外培养
采用含有10％新生牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的RPMI1640培养基。置于37℃，5％CO2，饱和湿度环境下培养。
(2)采用噻唑蓝比色法(MTT)检测不同浓度的HNK对K562细胞的增殖抑制率
取相同密度(2×105个/ml)的对数生长期K562细胞加于96孔微量培养板中，分别加入不同终浓度的HNK，每个药物浓度组设5个复孔。培养24h，48h和72h后检测计算细胞增殖抑制率。实验重复4次。
(3)倒置相差显微镜观察K562细胞的形态
(4)FCM用Annexin V/PI双染的方法检测K562细胞的凋亡率
将K562细胞经过不同终浓度的HNK处理24h和48h后，分别收集各组细胞，悬于binding buffer液中，加入AnnexinV，避光室温反应15 min，加入binding buffer液，上机检测前加入PI，用流式细胞术检测细胞凋亡率。
(5)RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA的表达
将K562细胞经过不同终浓度的HNK处理48h后，分别收集各组细胞，以Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度并定量，取2μg逆转录合成cDNA。以特异的引物扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳后，图像分析系统分析扩增条带光密度值，以β-actin为内参，计算bcl-2和bax mRNA相对表达水平。
[结果]
(1)HNK抑制K562细胞增殖显示HNK在5μg/ml时，作用24h即对细胞的增殖有抑制作用，抑制率为8.33％。随着药物浓度的增加、作用时间的延长，细胞抑制率明显增加。25μg/ml的HNK对K562细胞作用72h的抑制率达98.03％，抑制率呈现出剂量、时间效应关系。HNK对K562细胞24h、48h、72h的IC50分别为29.37±0.79μg/ml、13.35±0.18μg/ml、10.07±0.19μg/ml。
(2)倒置相差显微镜观察结果显示HNK作用于K562细胞，随着HNK浓度的增加和作用时间的延长，活细胞数越少，细胞透明度和亮度都降低，体积变小，而空白对照的K562细胞呈增殖生长。
(3)流式细胞仪检测不同浓度的HNK作用于K562细胞24h和48h，随着浓度的增加和作用时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增多，各实验组与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。实验组之间相互比较，差异亦具有统计学意义(P<0.01)。
(4)HNK作用于K562细胞48h后，随着药物浓度的增加，bcl-2 mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义，而调亡相关基因bax mRNA表达逐渐增多，二者比值减少，呈浓度依赖性。
[结论]
(1)HNK对白血病细胞系K562细胞的增殖有明显的抑制作用，并呈现出剂量和时间效应关系。
(2)HNK可诱导K562细胞的凋亡。
(3)HNK诱导K562细胞的凋亡可能与上调促凋亡基因bax的表达有关，HNk。
急性白血病是一类起源于造血干细胞病变的恶性克隆性疾病，虽然近年来以大剂量化疗为主的综合疗法的广泛应用，使其治疗效果有了明显提高，但仍然有相当一部分患者因疾病复发或耐药而转变成难治，因此积极寻求新的治疗方法，在当前仍然显得尤为必要。
中药厚朴属木兰科木兰属乔木植物，其树皮为我国传统中药材，和厚朴酚(honokiol，HNK)是其主要化学成分之一，属于联苯酚类化合物。现代医学发现和厚朴酚具有抗氧化、抗炎、抗焦虑、抗菌、抗血栓形成和抗肿瘤的作用。近年来体内外试验均证实和厚朴酚对多种实体肿瘤细胞有抑制作用，引起人们极大关注，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡，促进部分肿瘤细胞分化，抗肿瘤血管生成，和阻止肿瘤转移，逆转部分实体瘤耐药细胞的耐药性有关。
本实验拟观察和厚朴酚对人急性红白血病细胞株K562细胞的增殖、凋亡以及对凋亡相关基因表达的影响，为和厚朴酚治疗急性髓系白血病提供理论依据。
[方法]
(1)K562白血病细胞株的体外培养
采用含有10％新生牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的RPMI1640培养基。置于37℃，5％CO2，饱和湿度环境下培养。
(2)采用噻唑蓝比色法(MTT)检测不同浓度的HNK对K562细胞的增殖抑制率
取相同密度(2×105个/ml)的对数生长期K562细胞加于96孔微量培养板中，分别加入不同终浓度的HNK，每个药物浓度组设5个复孔。培养24h，48h和72h后检测计算细胞增殖抑制率。实验重复4次。
(3)倒置相差显微镜观察K562细胞的形态
(4)FCM用Annexin V/PI双染的方法检测K562细胞的凋亡率
将K562细胞经过不同终浓度的HNK处理24h和48h后，分别收集各组细胞，悬于binding buffer液中，加入AnnexinV，避光室温反应15 min，加入binding buffer液，上机检测前加入PI，用流式细胞术检测细胞凋亡率。
(5)RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA的表达
将K562细胞经过不同终浓度的HNK处理48h后，分别收集各组细胞，以Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度并定量，取2μg逆转录合成cDNA。以特异的引物扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳后，图像分析系统分析扩增条带光密度值，以β-actin为内参，计算bcl-2和bax mRNA相对表达水平。
[结果]
(1)HNK抑制K562细胞增殖显示HNK在5μg/ml时，作用24h即对细胞的增殖有抑制作用，抑制率为8.33％。随着药物浓度的增加、作用时间的延长，细胞抑制率明显增加。25μg/ml的HNK对K562细胞作用72h的抑制率达98.03％，抑制率呈现出剂量、时间效应关系。HNK对K562细胞24h、48h、72h的IC50分别为29.37±0.79μg/ml、13.35±0.18μg/ml、10.07±0.19μg/ml。
(2)倒置相差显微镜观察结果显示HNK作用于K562细胞，随着HNK浓度的增加和作用时间的延长，活细胞数越少，细胞透明度和亮度都降低，体积变小，而空白对照的K562细胞呈增殖生长。
(3)流式细胞仪检测不同浓度的HNK作用于K562细胞24h和48h，随着浓度的增加和作用时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增多，各实验组与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。实验组之间相互比较，差异亦具有统计学意义(P<0.01)。
(4)HNK作用于K562细胞48h后，随着药物浓度的增加，bcl-2 mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义，而调亡相关基因bax mRNA表达逐渐增多，二者比值减少，呈浓度依赖性。
[结论]
(1)HNK对白血病细胞系K562细胞的增殖有明显的抑制作用，并呈现出剂量和时间效应关系。
(2)HNK可诱导K562细胞的凋亡。
(3)HNK诱导K562细胞的凋亡可能与上调促凋亡基因bax的表达有关，HNk。