【摘 要】
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DNA双链断裂（DNA double strand breaks,DSBs）是最严重的DNA损伤形式之一,哺乳动物细胞主要通过非同源末端连接（non homologous end jointing,NHEJ）与同源重组（homologous recombination,HR）两种途径修复。TAB182（TNKS1-binding protein of 182 k Da）,在酵母双杂交试验中发现其能
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DNA双链断裂（DNA double strand breaks,DSBs）是最严重的DNA损伤形式之一,哺乳动物细胞主要通过非同源末端连接（non homologous end jointing,NHEJ）与同源重组（homologous recombination,HR）两种途径修复。TAB182（TNKS1-binding protein of 182 k Da）,在酵母双杂交试验中发现其能够与多聚ADP核糖聚合酶家族成员（TNKS1）产生相互作用。TAB182作为一种DNA损伤修复相关蛋白,参与多种DNA双链断裂修复途径的调控。我们实验室报道TAB182可通过促进电离辐射后DNA-PKcs的激活促进非同源末端连接（NHEJ）修复途径,并促进G2/M周期阻滞。此外,TAB182敲低的A549细胞Rad51 foci的形成受到抑制,进而影响同源重组修复,但是其具体机制还不清楚。目的:结合已有的研究报道与本实验室前期结果,本研究旨在阐述TAB182参与调控同源重组修复的分子机制,对TAB182今后作为临床放射治疗中的治疗靶点有着重要意义。方法:（1）通过对野生型及TAB182敲低的MCF-7细胞进行m RNA测序分析,筛选m RNA表达差异的HR修复相关基因;（2）q PCR与Western blotting（WB）分别从m RNA与蛋白水平验证测序分析结果;（3）免疫荧光染色（IF）验证其相关蛋白荧光的表达,并检测RAD51 foci的表达及Brd U foci的形成,观察TAB182的缺失是否对HR修复及剪切过程3’单链DNA（ss DNA）的形成产生影响;（4）流式细胞术检测TAB182敲低的MCF-7细胞电离辐射后的细胞周期和凋亡变化;（5）克隆形成及CCK8实验检测TAB182对MCF-7细胞的放化疗敏感性的调节作用;（6）在HEK-293T细胞中表达外源性Flag-TAB182,IP质谱寻找TAB182的相互作用蛋白。结果:（1）RNA测序结果发现HR修复相关基因RPA2在TAB182敲低的MCF-7细胞中下调;（2）q-PCR与WB结果表明,TAB182敲低可明显降低RPA2的m RNA与蛋白表达;（3）IF结果表明,与对照组相比,TAB182缺陷细胞中RPA2、RAD51以及Brd U的foci显著减少;（4）m RNA半衰期实验表明,TAB182缺陷细胞RPA2 m RNA半衰期变短;（5）细胞周期结果表明,TAB182缺陷细胞电离辐射后G2/M期阻滞时间显著延长;（6）细胞凋亡结果表明,与对照组相比,TAB182缺陷细胞的细胞凋亡比例显著增加;（7）克隆形成结果表明,与对照组相比,TAB182缺陷细胞存活率降低;CCK8结果表明,在TAB182缺陷细胞中添加PARP1抑制剂Olaparib后,其细胞增殖活性显著降低;证明TAB182缺陷的细胞对放化疗的敏感性增加;（8）质谱结果表明,TAB182与TNKS、CNOT家族成员等存在相互作用。结论:本研究揭示TAB182通过维持RPA2 m RNA的稳定性,促进RPA2的表达,进而促进断裂位点的同源重组修复。TAB182缺失的肿瘤细胞对放射、PARP抑制剂高度敏感,为肿瘤的治疗提供了新的靶点与理论依据。
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