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摘要：目的 探讨消痰散结方对MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤微卫星不稳定的作用机制。方法 采用MKN-45人胃癌细胞株建立裸鼠皮下瘤模型皮下传3代作为实验模型的瘤源，采用OB胶黏合法建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。20只模型裸鼠分为模型组和中药组。中药组予消痰散结方干预6周后，测瘤质量，计算抑瘤率并检测5个微卫星不稳定位点（D17S250、D2S123、D5S346、Bat-25和Bat-26）。结果 中药组的瘤质量明显低于模型组（P<0.01），其抑瘤率为40.84%。模型组的肿瘤组织中能扩增到5个微卫星位点，其中微卫星位点D2S123、D5S346出现某些延长和缩短。使用消痰散结方干预6周后，微卫星位点D2S123、D5S346的变异趋于稳定。结论 消痰散结方能抑制MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的微卫星不稳定。
关键词：消痰散结方；微卫星不稳定；胃癌；裸鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0032-03
近年来，越来越多的实验研究证实微卫星不稳定（MSI）与胃癌的发生发展有密切关联[1-3]，MSI在胃癌的发生率大约为14.0%～45.0%，个别高达90.0%[4-6]。消痰散结方为本院魏品康教授多年临床经验总结，前期研究显示，消痰散结方改善晚期胃癌患者症状有效率达82.9%，卡氏评分提高率84.4%，中位生存期12.25个月，3年生存率22.10%，已获明显疗效[7]。本实验为进一步研究消痰散结方干预胃癌的作用机制，观察其对MSI的影响。
1 实验材料
1.1 动物
裸鼠20只，雄性，SPF级，体质量18～20 g。购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SYXK（沪）2007-0005；使用许可证号：SYXK（沪）2007-0006。
1.2 药物
消痰散结方由天南星、半夏、全蝎、蜈蚣等组成，中药材购自上海雷允上公司，本院制剂室制备，原药材浓度为3.35 g/mL；喃氟啶：购自上海医药集团公司华联制药厂，批号060102。
1.3 细胞株
MKN-45胃癌细胞株，购自中国科学院细胞所。
1.4 试剂与主要仪器
动物组织基因组小量抽提试剂盒：High Pure PCR Template Preparation Kit，规格：1 kit （100 purifications），购自罗氏制药。测序仪试剂：Bigdye V3.1，货号：4323161，购自ABI公司。3130测序仪，购自ABI公司。9700 PCR仪，购自ABI公司。
2 实验方法
2.1 造模
2.1.1 细胞培养 MKN-45细胞以含10%小牛血清的RPMI- 1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化后，PBS洗2次，调整细胞浓度为1×107个/mL的细胞悬液。
2.1.2 裸鼠皮下瘤模型建立 取1只裸鼠，将0.2 mL细胞悬液接种于右侧近腋部皮下，当皮下移植瘤长至直径约1 cm时剥取移植瘤，切成1 mm×1 mm×1 mm瘤块，再经套管针转种至另一只裸小鼠腋部皮下，如此反复进行鼠间传代。本研究以第3代皮下移植瘤为实验模型的瘤源。
2.1.3 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 在操作台上，从腋皮下剥取肿瘤组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤块备用。实验动物禁食12 h，用10%水合氯醛按照裸鼠体质量0.03 mL/10 g腹腔注射麻醉后，常规手术，在胃大弯近胃窦处用1 mL无菌空针头划破胃壁浆膜层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹龛，植入1块瘤组织于凹内，并在瘤块表面滴OB胶1滴，40 s凝固后将胃壁回纳入腹腔，0号丝线缝合腹膜及皮肤，关腹，复苏。20只荷瘤鼠均复制成功。养至6周。脱颈处死裸鼠荷瘤小鼠，分别取每只小鼠的胃肿瘤组织。
2.2 分组
选取MKN-45人胃癌皮下移植瘤裸鼠20只，分为模型组和中药组，每组10只。模型组每只给予生理盐水0.4 mL/d灌胃。中药组每只给予原药材浓度为3.35 g/mL消痰散结方0.4 mL/d灌胃，连续给药6周。
2.3 观察指标与方法
2.3.1 肿瘤组织基因组DNA提取及PCR扩增 采用RT-PCR方法。取肿瘤组织，按试剂盒说明书进行染色体抽提，然后进行PCR扩增。PCR反应体系：20 ?L。采用美国国立癌症研究所（NCI）推荐[8-9]的5个微卫星检测基因片段（D2S123、D3S1067、D3S1577、D17S250和BAT26）设计引物。所有引物序列查自NCBI uniSTS数据库，引物合成自上海英俊生物技术有限公司，实验条件：95 ℃、5 min，95 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃、30 s， 30个循环，72 ℃、1 min，4 ℃保存。引物设计及反应体系见表1。PCR产物经纯化后添加内标，直接在3130测序仪中进行毛细管电泳。Data collection软件自动进行数据收集和处理，并生成原始的样品数据文件。
2.3.2 瘤质量和抑制率计算
灌胃结束后，第43日麻醉后处死小鼠，分离肿瘤，称取瘤质量。计算抑瘤率[（模型组瘤质量-中药组瘤质量）÷模型组瘤质量]。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料用—x±s表示。采用Levene检验进行方差齐性检验，数据资料均方差齐，采用完全随机的方差分析（ANOVA），多个均数的比较用LSD-t检验。检验水准为0.05。 4 结果
4.1 荷瘤裸鼠瘤质量和抑瘤率（见表2）
4.2 荷瘤裸鼠肿瘤微卫星不稳定变化（见表3）
表3显示，在模型组肿瘤组织中能扩增到的5个微卫星位点（D17S250、D2S123、D5S346、Bat-25和Bat-26）中，微卫星位点D2S123、D5S346出现某些延长和缩短，但在使用消痰散结方治疗后，D2S123、D5S346的变异出现稳定趋势。
5 讨论
微卫星（microsatellite，MS）是分布生物基因种系中短串核苷酸的简单重复序列，重复单位为2～6个核苷酸，重复次数在20～100左右，分为核心区和侧翼区两部分。MS主要位于基因的编码区附近，也可位于内含子、启动子和Alu序列中，是基因重组和变异的来源，并通过改变DNA的结构或与特异的蛋白质结合而发挥基因调控作用。DNA复制时，MS序列很容易形成错配或重组错误，人体自身的错配修复系统将及时修复这些错误，当细胞的错配修复系统功能障碍时，这些错误得不到修复，基因片段或增加或减少，称之为MSI状态[10-11]。亦是肿瘤发生的重要原因之一[12]。
在中医学理论中，认为痰与肿瘤的发生发展密切相关，早在元代朱丹溪就已经提出“凡人上、中、下有块者，多是痰”，“痰挟瘀血，遂成窠囊”。本院魏品康教授从事胃癌临床工作40余年，认为胃癌的发生是由于3个方面因素（六淫入侵，饮食不宜，七情内伤）导致气机阻滞，津液运化失常，聚而成痰，痰浊内蕴，郁而化火，阻碍气机，最终导致痰气火相杂，而致细胞突变，发生肿瘤。基于对胃癌病因病机“痰本质”的认识，魏品康教授提出胃癌治疗大法“消痰散结法”，总结出“消痰散结方”治疗胃癌，取得显著临床疗效。
消痰散结方由半夏、天南星、陈皮、全蝎、蜈蚣等药物组成。半夏燥湿化痰、消痞散结、降逆止呕，因其辛温而燥，为燥湿化痰之要药，尤善治脏腑之湿痰。天南星燥湿化痰、散结消肿，其燥湿化痰似半夏而温燥之性更甚。陈皮理气健脾、燥湿化痰。全蝎、蜈蚣可攻毒散结、通络止痛，性善走窜，通达内外，二药可协同增效，与半夏、天南星相使为用，不仅助其消除顽痰，更有穿透络脉、化痰开结之力，防止痰邪流窜脏腑经络。本方在消痰药物中辅以理气散结之品，使顽痰得以消散，病因得以根除。
在前期研究工作中，我们已经证实消痰散结方对细胞间质多种物质均有调控作用，包括对肿瘤血管生成、基质金属蛋白酶的影响等多方位、多角度干预肿瘤的复发转移[13-16]。本研究中发现消痰散结方对肿瘤有明显的抑制作用，中药组的瘤质量明显低于模型组（P<0.01），其抑瘤率为40.84%，并且消痰散结方可以改善MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的MS（D2S123、D5S346）不稳定性，将出现变异的微卫星位点趋于稳定。本研究为消痰散结方干预胃癌的作用机制提供了新思路。
参考文献：
[1] Kim MS， An CH， Kim SS， et al. Frameshift mutations of poly （adenosine diphosphate-ribose） polymerase genes in gastric and colorectal cancers with microsatellite instability[J]. Hum pathol，2011，42（9）：1289-1296.
[2] Kim H， An JY， Noh SH， et al. High microsatellite instability predicts good prognosis in intestinal-type gastric cancers[J]. J Gastroenterol Hepatol，2011，26（3）：585-592.
[3] Wada-Hiraike O， Yano T， Nei T， et a1. The DNA mismatch repair gene hMSH2 is a potent coact ivator of oestrogen receptor alpha[J]. Br J Cancer，2005，92（12）：2286-2291.
[4] Kim MS， Kyoung M， Kwon SJ， et a1. Genetic classification of intestinal-type and diffuse-type gastric cancers based on chromosomal loss and microsatellite instability[J]. Virchows Arch，2003，443：491-500.
[5] Yokozaki H， Ikehara N， Semba S， et al. BRAF/K-ras mutation， microsatellite instability， and promoter hypermethylation of Hmlh1/MGMT in human gastric carcionmas[J]. Gastric Cancer， 2004，7：246-253.
[6] Tsukamoto T， Mizoshita T， Otsuka T， et a1. Microsatellite instability is linked to loss of Hmlh1 expression in advanced gastric cancers：lack of relationship with the histological type and phenotype[J]. Gastric cancer，2005，8：164-172.
[7] 李相勇，魏品康.金龙蛇口服液治疗晚期胃癌临床观察[J].湖北中医杂志，2001，23（11）：3-5. [8] Boland CR， Thibodeau SN， Hamilton SR， et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition：development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer[J]. Cancer Res，1998，58（22）：5248-5257.
[9] Falchetti M， Saieva C， Lupi R， et al. Gastric cancer with high-level microsatellite instability：target gene mutations， clinicopathologic features， and long-term survival[J]. Hum Pathol，2008，39（6）：925-932.
[10] Hamelin R， Chalastanis A， Colas C， et al. Clinical and molecular consequences of microsatellite instability in human cancers[J]. Bull Cancer，2008，95（1）：121-132.
[11] Hasuo T， Semba S， Satake S， et al. Superficially elevated-type serrated hyperplastic lesion of the stomach with minute adenocarcinoma[J]. Dig Endosc，2009，21（2）：101-105.
[12] Gargano G， Calcara D， Corsale S， et al. Aberrant methylation within RUNX3 CpG island associated with the nuclear and mitochondrial microsatellite instability in sporadic gastric cancer. Results of a GOIM （Gruppo Oncologico dell'Italia Meridionale） prospective study[J].Ann Oncol，2007，18（6）：103-109.
[13] 苏晓妹，李峻，许玲，等.消痰散结方对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成及胃癌组织中VEGF表达的影响[J].山东中医药大学学报，2003，27（4）：296- 297.
[14] 肖艳，魏品康，许玲，等.消痰散结方对小鼠MKN-45人胃癌组织中MMP2表达的影响[J].成都中医药大学学报，2002，25（4）：32-33.
[15] 肖艳，魏品康，许玲，等.消痰散结方对小鼠MKN-45人胃癌组织中MTl-MMP表达的影响[J].辽宁中医学院学报，2003，5（3）：271-272.
[16] 李峻，魏品康，许玲.消痰散结方对血管内皮细胞小管形成的影响[J].成都中医药大学学报，2003，26（4）：25-26.
（收稿日期：2013-05-22，编辑：华强）
关键词：消痰散结方；微卫星不稳定；胃癌；裸鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0032-03
近年来，越来越多的实验研究证实微卫星不稳定（MSI）与胃癌的发生发展有密切关联[1-3]，MSI在胃癌的发生率大约为14.0%～45.0%，个别高达90.0%[4-6]。消痰散结方为本院魏品康教授多年临床经验总结，前期研究显示，消痰散结方改善晚期胃癌患者症状有效率达82.9%，卡氏评分提高率84.4%，中位生存期12.25个月，3年生存率22.10%，已获明显疗效[7]。本实验为进一步研究消痰散结方干预胃癌的作用机制，观察其对MSI的影响。
1 实验材料
1.1 动物
裸鼠20只，雄性，SPF级，体质量18～20 g。购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SYXK（沪）2007-0005；使用许可证号：SYXK（沪）2007-0006。
1.2 药物
消痰散结方由天南星、半夏、全蝎、蜈蚣等组成，中药材购自上海雷允上公司，本院制剂室制备，原药材浓度为3.35 g/mL；喃氟啶：购自上海医药集团公司华联制药厂，批号060102。
1.3 细胞株
MKN-45胃癌细胞株，购自中国科学院细胞所。
1.4 试剂与主要仪器
动物组织基因组小量抽提试剂盒：High Pure PCR Template Preparation Kit，规格：1 kit （100 purifications），购自罗氏制药。测序仪试剂：Bigdye V3.1，货号：4323161，购自ABI公司。3130测序仪，购自ABI公司。9700 PCR仪，购自ABI公司。
2 实验方法
2.1 造模
2.1.1 细胞培养 MKN-45细胞以含10%小牛血清的RPMI- 1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化后，PBS洗2次，调整细胞浓度为1×107个/mL的细胞悬液。
2.1.2 裸鼠皮下瘤模型建立 取1只裸鼠，将0.2 mL细胞悬液接种于右侧近腋部皮下，当皮下移植瘤长至直径约1 cm时剥取移植瘤，切成1 mm×1 mm×1 mm瘤块，再经套管针转种至另一只裸小鼠腋部皮下，如此反复进行鼠间传代。本研究以第3代皮下移植瘤为实验模型的瘤源。
2.1.3 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 在操作台上，从腋皮下剥取肿瘤组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤块备用。实验动物禁食12 h，用10%水合氯醛按照裸鼠体质量0.03 mL/10 g腹腔注射麻醉后，常规手术，在胃大弯近胃窦处用1 mL无菌空针头划破胃壁浆膜层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹龛，植入1块瘤组织于凹内，并在瘤块表面滴OB胶1滴，40 s凝固后将胃壁回纳入腹腔，0号丝线缝合腹膜及皮肤，关腹，复苏。20只荷瘤鼠均复制成功。养至6周。脱颈处死裸鼠荷瘤小鼠，分别取每只小鼠的胃肿瘤组织。
2.2 分组
选取MKN-45人胃癌皮下移植瘤裸鼠20只，分为模型组和中药组，每组10只。模型组每只给予生理盐水0.4 mL/d灌胃。中药组每只给予原药材浓度为3.35 g/mL消痰散结方0.4 mL/d灌胃，连续给药6周。
2.3 观察指标与方法
2.3.1 肿瘤组织基因组DNA提取及PCR扩增 采用RT-PCR方法。取肿瘤组织，按试剂盒说明书进行染色体抽提，然后进行PCR扩增。PCR反应体系：20 ?L。采用美国国立癌症研究所（NCI）推荐[8-9]的5个微卫星检测基因片段（D2S123、D3S1067、D3S1577、D17S250和BAT26）设计引物。所有引物序列查自NCBI uniSTS数据库，引物合成自上海英俊生物技术有限公司，实验条件：95 ℃、5 min，95 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃、30 s， 30个循环，72 ℃、1 min，4 ℃保存。引物设计及反应体系见表1。PCR产物经纯化后添加内标，直接在3130测序仪中进行毛细管电泳。Data collection软件自动进行数据收集和处理，并生成原始的样品数据文件。
2.3.2 瘤质量和抑制率计算
灌胃结束后，第43日麻醉后处死小鼠，分离肿瘤，称取瘤质量。计算抑瘤率[（模型组瘤质量-中药组瘤质量）÷模型组瘤质量]。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料用—x±s表示。采用Levene检验进行方差齐性检验，数据资料均方差齐，采用完全随机的方差分析（ANOVA），多个均数的比较用LSD-t检验。检验水准为0.05。 4 结果
4.1 荷瘤裸鼠瘤质量和抑瘤率（见表2）
4.2 荷瘤裸鼠肿瘤微卫星不稳定变化（见表3）
表3显示，在模型组肿瘤组织中能扩增到的5个微卫星位点（D17S250、D2S123、D5S346、Bat-25和Bat-26）中，微卫星位点D2S123、D5S346出现某些延长和缩短，但在使用消痰散结方治疗后，D2S123、D5S346的变异出现稳定趋势。
5 讨论
微卫星（microsatellite，MS）是分布生物基因种系中短串核苷酸的简单重复序列，重复单位为2～6个核苷酸，重复次数在20～100左右，分为核心区和侧翼区两部分。MS主要位于基因的编码区附近，也可位于内含子、启动子和Alu序列中，是基因重组和变异的来源，并通过改变DNA的结构或与特异的蛋白质结合而发挥基因调控作用。DNA复制时，MS序列很容易形成错配或重组错误，人体自身的错配修复系统将及时修复这些错误，当细胞的错配修复系统功能障碍时，这些错误得不到修复，基因片段或增加或减少，称之为MSI状态[10-11]。亦是肿瘤发生的重要原因之一[12]。
在中医学理论中，认为痰与肿瘤的发生发展密切相关，早在元代朱丹溪就已经提出“凡人上、中、下有块者，多是痰”，“痰挟瘀血，遂成窠囊”。本院魏品康教授从事胃癌临床工作40余年，认为胃癌的发生是由于3个方面因素（六淫入侵，饮食不宜，七情内伤）导致气机阻滞，津液运化失常，聚而成痰，痰浊内蕴，郁而化火，阻碍气机，最终导致痰气火相杂，而致细胞突变，发生肿瘤。基于对胃癌病因病机“痰本质”的认识，魏品康教授提出胃癌治疗大法“消痰散结法”，总结出“消痰散结方”治疗胃癌，取得显著临床疗效。
消痰散结方由半夏、天南星、陈皮、全蝎、蜈蚣等药物组成。半夏燥湿化痰、消痞散结、降逆止呕，因其辛温而燥，为燥湿化痰之要药，尤善治脏腑之湿痰。天南星燥湿化痰、散结消肿，其燥湿化痰似半夏而温燥之性更甚。陈皮理气健脾、燥湿化痰。全蝎、蜈蚣可攻毒散结、通络止痛，性善走窜，通达内外，二药可协同增效，与半夏、天南星相使为用，不仅助其消除顽痰，更有穿透络脉、化痰开结之力，防止痰邪流窜脏腑经络。本方在消痰药物中辅以理气散结之品，使顽痰得以消散，病因得以根除。
在前期研究工作中，我们已经证实消痰散结方对细胞间质多种物质均有调控作用，包括对肿瘤血管生成、基质金属蛋白酶的影响等多方位、多角度干预肿瘤的复发转移[13-16]。本研究中发现消痰散结方对肿瘤有明显的抑制作用，中药组的瘤质量明显低于模型组（P<0.01），其抑瘤率为40.84%，并且消痰散结方可以改善MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的MS（D2S123、D5S346）不稳定性，将出现变异的微卫星位点趋于稳定。本研究为消痰散结方干预胃癌的作用机制提供了新思路。
参考文献：
[1] Kim MS， An CH， Kim SS， et al. Frameshift mutations of poly （adenosine diphosphate-ribose） polymerase genes in gastric and colorectal cancers with microsatellite instability[J]. Hum pathol，2011，42（9）：1289-1296.
[2] Kim H， An JY， Noh SH， et al. High microsatellite instability predicts good prognosis in intestinal-type gastric cancers[J]. J Gastroenterol Hepatol，2011，26（3）：585-592.
[3] Wada-Hiraike O， Yano T， Nei T， et a1. The DNA mismatch repair gene hMSH2 is a potent coact ivator of oestrogen receptor alpha[J]. Br J Cancer，2005，92（12）：2286-2291.
[4] Kim MS， Kyoung M， Kwon SJ， et a1. Genetic classification of intestinal-type and diffuse-type gastric cancers based on chromosomal loss and microsatellite instability[J]. Virchows Arch，2003，443：491-500.
[5] Yokozaki H， Ikehara N， Semba S， et al. BRAF/K-ras mutation， microsatellite instability， and promoter hypermethylation of Hmlh1/MGMT in human gastric carcionmas[J]. Gastric Cancer， 2004，7：246-253.
[6] Tsukamoto T， Mizoshita T， Otsuka T， et a1. Microsatellite instability is linked to loss of Hmlh1 expression in advanced gastric cancers：lack of relationship with the histological type and phenotype[J]. Gastric cancer，2005，8：164-172.
[7] 李相勇，魏品康.金龙蛇口服液治疗晚期胃癌临床观察[J].湖北中医杂志，2001，23（11）：3-5. [8] Boland CR， Thibodeau SN， Hamilton SR， et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition：development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer[J]. Cancer Res，1998，58（22）：5248-5257.
[9] Falchetti M， Saieva C， Lupi R， et al. Gastric cancer with high-level microsatellite instability：target gene mutations， clinicopathologic features， and long-term survival[J]. Hum Pathol，2008，39（6）：925-932.
[10] Hamelin R， Chalastanis A， Colas C， et al. Clinical and molecular consequences of microsatellite instability in human cancers[J]. Bull Cancer，2008，95（1）：121-132.
[11] Hasuo T， Semba S， Satake S， et al. Superficially elevated-type serrated hyperplastic lesion of the stomach with minute adenocarcinoma[J]. Dig Endosc，2009，21（2）：101-105.
[12] Gargano G， Calcara D， Corsale S， et al. Aberrant methylation within RUNX3 CpG island associated with the nuclear and mitochondrial microsatellite instability in sporadic gastric cancer. Results of a GOIM （Gruppo Oncologico dell'Italia Meridionale） prospective study[J].Ann Oncol，2007，18（6）：103-109.
[13] 苏晓妹，李峻，许玲，等.消痰散结方对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成及胃癌组织中VEGF表达的影响[J].山东中医药大学学报，2003，27（4）：296- 297.
[14] 肖艳，魏品康，许玲，等.消痰散结方对小鼠MKN-45人胃癌组织中MMP2表达的影响[J].成都中医药大学学报，2002，25（4）：32-33.
[15] 肖艳，魏品康，许玲，等.消痰散结方对小鼠MKN-45人胃癌组织中MTl-MMP表达的影响[J].辽宁中医学院学报，2003，5（3）：271-272.
[16] 李峻，魏品康，许玲.消痰散结方对血管内皮细胞小管形成的影响[J].成都中医药大学学报，2003，26（4）：25-26.
（收稿日期：2013-05-22，编辑：华强）