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[摘要] 目的 观察灵芝孢子粉对心肌缺血大鼠的干预作用及抗氧化损伤的药物疗效。 方法 将30只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组及灵芝孢子粉治疗组，雌雄各半。对照组：常规饲养，不做其他处置。模型组：同对照组常规饲养3周后，行左冠状动脉前降支结扎建立心肌缺血模型后继续饲养1周。治疗组：灵芝孢子粉按2.5g/kg灌胃给药3周，再行左冠状动脉前降支结扎建立心肌缺血模型后，继续给药1周。动物处死取材后，观察心肌梗死面积，血清MDA含量及SOD活性变化。 结果 灵芝孢子粉治疗组明显缩小心肌梗死区面积，降低血清MDA含量，提高血清SOD活性。 结论 灵芝孢子粉对大鼠实验性心肌缺血具有保护性作用，其机制可能通过降低脂质过氧化损伤有关。
[关键词]灵芝孢子粉；心肌缺血；氧化损伤
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）21-24-03
灵芝是中国传统珍贵药材，具有较高的药用价值，现代药理学研究证实，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗氧化、降血脂与抗衰老等多种功效[1]。灵芝孢子是灵芝发育后期弹射出来的种子，含有比灵芝更丰富的多糖肽、酶类、蛋白质、硒元素等成分，药效远超过其母体灵芝[2]。梁欣等[3]研究发现灵芝孢子粉在CHP、VC/Fe2+及CCl4/NADP激发的肝微粒体脂质过氧化模型中具有明显的抑制作用（P<0.01），各剂量组MDA含量较对照组都有显著下降，且随孢子粉浓度增加，MDA含量相应减少，但在高浓度（40mg/mL）时MDA含量略有回升，表明其可能通过非酶途径发挥其抗氧化作用。本文通过灵芝孢子粉对心肌大鼠心肌梗死面积，血清MDA及SOD等含量变化，探讨其对大鼠心肌缺血脂质过氧化损伤的影响，为其临床用药提供基本理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 30只健康Wistar大鼠，清洁级，体重（180±20）g，雌雄各半，由吉林大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（吉）：2010-0005。
1.1.2 药品 灵芝孢子粉购自吉林农业大学珍源参业高科技有限公司；SOD和MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；2、3、5-氯化三苯基四氮唑（TTC）购自中国医药上海试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 分组 30只实验Wistar大鼠随机分为三组，即空白对照组、心肌缺血模型组及灵芝孢子粉治疗组，雌雄各半。
1.2.2 心肌缺血模型建立 模型组及治疗组大鼠乙醚吸入麻醉固定，常规消毒皮肤，于胸部胸骨旁左侧纵向切开皮肤，用止血钳打开胸腔，于左心耳与肺动脉圆锥间左心耳下1mm左右穿线结扎左冠状动脉前降支后迅速将心脏复位，关闭胸腔。
1.2.3 动物给药 治疗组在建立心肌缺血模型前开始按2.5g/kg灌胃给予灵芝孢子粉3周，模型建立后继续给药1周。
1.2.4 取材与指标观察 大鼠用10%水合氯醛（0.3mL/100g）麻醉，打开腹腔，通过腹主动脉插管法取新鲜血液3mL，置LDZ5-2低速自动平衡离心机，2500rpm/min离心15min，取上清备用。同时开胸迅速取出心脏，用冷生理盐水清洗，剔除结缔组织，滤纸吸干，剪掉右心室，将左心室心肌横向切成2～3mm薄片，采用TTC显色方法，利用BI-2000图象分析系统分别测量左室心肌梗死面积和左室全面积，计算心肌梗死面积百分比。同时按SOD和MDA试剂盒说明，利用分光光度法测定大鼠血清SOD活性及MDA含量。
1.3 统计学处理
采用SPSS13.0软件进行统计学处理，数据以（）表示，多组间比较用One Way ANOVA（单因素方差分析）方法，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 灵芝孢子粉对心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响
心肌缺血大鼠的心肌组织切片经TTC染色结果显示，正常心肌组织呈现红色，心肌梗死区域呈现白色。同对照组比较，模型组与治疗组均不同程度出现心肌梗死区域，而治疗组同模型组比较，梗死区域明显缩小。见图1。
采用BI-2000图象分析系统测量心肌梗死面积的结果表明，与模型组比较灵芝孢子粉治疗组能够明显缩小心肌梗死面积（P<0.01），具有统计学意义。见表1。
2.2 灵芝孢子粉对心肌缺血大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响
对照组大鼠血清具有较高的SOD活性，但MDA含量处于较低水平。模型组与对照组比较SOD活性降低，相应出现了MDA含量增加（P<0.05或P<0.01），差异具有统计学意义。相比灵芝孢子粉治疗组血清SOD活性比模型组增加，而MDA含量下降（P<0.05或P<0.01），差异具有统计学意义。见表2。
3 讨论
心肌缺血性损伤常见于冠状动脉粥样硬化和（或）冠状动脉痉挛引起的血管腔阻塞或狭窄，导致心肌缺血、缺氧或坏死，临床发病率和死亡率较高。有研究发现，脂质过氧化损伤和炎症反应在心肌缺血性损伤的发生发展中起着关键作用[4-5]。当机体缺血缺氧时可以诱发体内氧自由基代谢失衡，对机体产生破坏性病理改变。体内堆积过量氧自由基时可引起蛋白、脂质及DNA损伤，并能够诱发炎症反应[6-7]。魏娜等[8]研究发现，结扎左冠状动脉前降支建立大鼠心肌梗死模型后，模型组大鼠心功能明显受损，血清中抗氧化物酶的活性降低，脂质过氧化物含量升高，且炎症因子含量升高。在缺血过程中诱发的氧化应激反应，生成大量活性氧（ROS）并直接损伤心肌，同时炎症级联反应可进一步促进ROS的生成，加重损伤[9]。MDA是机体内脂质过氧化后产生的活性氧自由基基团，是缺血性损伤的重要衡量指标。SOD是还原酶类，能清除机体内氧自由基，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着非常关键的作用。王勇等[10]研究发现，冠心病心肌缺血血瘀证中，氧化应激损伤反应贯了血瘀证的始终，氧化应激关键分子超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、细胞色素C（Cyto C）等浓度变化趋势与氧化应激损伤程度一致。因此，以氧化应激为靶点，寻找有效抗心肌缺血性损伤药物成为可能。灵芝为传统中药，具有2000多年的药用历史，主要成分有灵芝多糖、生物碱、蛋白酶类、三萜类等，药用价值非常广泛[11-12]。游育红等[13]研究发现灵芝多糖可以抑制氧自由基对细胞器的损伤，对细胞凋亡、细胞坏死也有很好的疗效。胡太平等[14]研究证明了，在血管壁中产生O2的NHDPH氧化酶酶系的活性受到灵芝多糖的抑制。Jia等[15]研究发现灵芝多糖可以使大鼠体内抗氧化酶量、胰岛素量有明显升高，脂质过氧化作用和血糖含量明显下降，表明其可作为一种有效的抗氧化物。本实验以灵芝孢子粉按2.5g/kg灌胃给药3周，再行大鼠左冠状动脉前降支结扎建立心肌缺血模型后，继续给药1周。经取材测定心肌梗死面积及血清SOD活性和MDA含量变化后，发现灵芝孢子粉治疗组同模型组比较，能够缩小心肌缺血大鼠的心肌梗死面积，同时能升高血清SOD活性降低MDA含量，均具有统计学意义。提示了灵芝孢子粉对心肌缺血具有保护性作用，其机制可能通过抗脂质过氧化反应发挥效应。 [参考文献]
[1] 陈宝田，龙亚秋，李华，等.灵芝孢子粉的药理作用研究进展[J].中国药房，2010，21（15）：1439-1440.
[2] 罗志明.灵芝孢子的微量元素含量和药理应用分析[J].广东微量元素科学，2003，10（8）：42-48.
[3] 梁欣，海春旭，刘瑞，等.灵芝孢子粉对肝微粒体脂质过氧化模型影响[J].中国公共卫生，2006，22（4）：465-466.
[4] Kawaguchi M，Takahashi M，Hata T，et al.Inflammasome activation of cardiac fibroblasts is essential for myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Circulation，2011，123（6）：594-604.
[5] Hori M，Nishida K.Oxidative stress and left ventricular remodelling after myocardial infarction[J].Cardiovasc Res，2009，81（3）：457-464.
[6] Vanden Hoek TL，Shao Z，LiC，et al.Reperfusion in jury in cardiacm yocytes after stim- ulated ischemia [J].Am J Physiol，1996，270：1334-1341.
[7] Stadtman ER，Levine RL.Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins[J].Amino Acids，2003，25（3-4）：207-218.
[8] 魏娜，袁丁，徐媛青，等.竹节参总皂苷对大鼠心肌梗死的保护作用[J].中药药理与临床，2013，29（3）：75-78.
[9] Zhang N，Andresen BT，Zhang C.Inflammation and reactive oxygen species in cardiovascular disease[J].World J Cardiol，2010，2（12）：408-410.
[10] 王勇，王思轩，李春，等.氧化应激损伤反应在冠心病心肌缺血血瘀证中的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2011，17（1）：58-60.
[11] 叶鹏飞，张美萍，王康宇，等.灵芝主要成分及其药理作用的研究进展综述[J].食用药菌，2013，21（3）：158-161.
[12] 杨锦生.灵芝主要化学成分及其药理作用研究述评[J].中华中医药学刊，2012，30（4）：906-907.
[13] 游育红，林志彬.灵芝多糖肽对ECV304细胞氧化损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007，23（11）：1510-1513.
[14] 胡太平，蔡尤彪.灵芝多糖对DOCA高血压大鼠主动脉NADPH氧化酶活性的影响[J].社区医学杂志，2007，13（5）：1-2.
[15] Jie Jia，Xi Zhang，Yong ShanHu，et a1.Evaluation of in vivo antioxidant activities of Canoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats[J].Food Chemistry，2009，115（1）：32.
（收稿日期：2013-09-26）
[关键词]灵芝孢子粉；心肌缺血；氧化损伤
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）21-24-03
灵芝是中国传统珍贵药材，具有较高的药用价值，现代药理学研究证实，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗氧化、降血脂与抗衰老等多种功效[1]。灵芝孢子是灵芝发育后期弹射出来的种子，含有比灵芝更丰富的多糖肽、酶类、蛋白质、硒元素等成分，药效远超过其母体灵芝[2]。梁欣等[3]研究发现灵芝孢子粉在CHP、VC/Fe2+及CCl4/NADP激发的肝微粒体脂质过氧化模型中具有明显的抑制作用（P<0.01），各剂量组MDA含量较对照组都有显著下降，且随孢子粉浓度增加，MDA含量相应减少，但在高浓度（40mg/mL）时MDA含量略有回升，表明其可能通过非酶途径发挥其抗氧化作用。本文通过灵芝孢子粉对心肌大鼠心肌梗死面积，血清MDA及SOD等含量变化，探讨其对大鼠心肌缺血脂质过氧化损伤的影响，为其临床用药提供基本理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 30只健康Wistar大鼠，清洁级，体重（180±20）g，雌雄各半，由吉林大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（吉）：2010-0005。
1.1.2 药品 灵芝孢子粉购自吉林农业大学珍源参业高科技有限公司；SOD和MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；2、3、5-氯化三苯基四氮唑（TTC）购自中国医药上海试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 分组 30只实验Wistar大鼠随机分为三组，即空白对照组、心肌缺血模型组及灵芝孢子粉治疗组，雌雄各半。
1.2.2 心肌缺血模型建立 模型组及治疗组大鼠乙醚吸入麻醉固定，常规消毒皮肤，于胸部胸骨旁左侧纵向切开皮肤，用止血钳打开胸腔，于左心耳与肺动脉圆锥间左心耳下1mm左右穿线结扎左冠状动脉前降支后迅速将心脏复位，关闭胸腔。
1.2.3 动物给药 治疗组在建立心肌缺血模型前开始按2.5g/kg灌胃给予灵芝孢子粉3周，模型建立后继续给药1周。
1.2.4 取材与指标观察 大鼠用10%水合氯醛（0.3mL/100g）麻醉，打开腹腔，通过腹主动脉插管法取新鲜血液3mL，置LDZ5-2低速自动平衡离心机，2500rpm/min离心15min，取上清备用。同时开胸迅速取出心脏，用冷生理盐水清洗，剔除结缔组织，滤纸吸干，剪掉右心室，将左心室心肌横向切成2～3mm薄片，采用TTC显色方法，利用BI-2000图象分析系统分别测量左室心肌梗死面积和左室全面积，计算心肌梗死面积百分比。同时按SOD和MDA试剂盒说明，利用分光光度法测定大鼠血清SOD活性及MDA含量。
1.3 统计学处理
采用SPSS13.0软件进行统计学处理，数据以（）表示，多组间比较用One Way ANOVA（单因素方差分析）方法，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 灵芝孢子粉对心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响
心肌缺血大鼠的心肌组织切片经TTC染色结果显示，正常心肌组织呈现红色，心肌梗死区域呈现白色。同对照组比较，模型组与治疗组均不同程度出现心肌梗死区域，而治疗组同模型组比较，梗死区域明显缩小。见图1。
采用BI-2000图象分析系统测量心肌梗死面积的结果表明，与模型组比较灵芝孢子粉治疗组能够明显缩小心肌梗死面积（P<0.01），具有统计学意义。见表1。
2.2 灵芝孢子粉对心肌缺血大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响
对照组大鼠血清具有较高的SOD活性，但MDA含量处于较低水平。模型组与对照组比较SOD活性降低，相应出现了MDA含量增加（P<0.05或P<0.01），差异具有统计学意义。相比灵芝孢子粉治疗组血清SOD活性比模型组增加，而MDA含量下降（P<0.05或P<0.01），差异具有统计学意义。见表2。
3 讨论
心肌缺血性损伤常见于冠状动脉粥样硬化和（或）冠状动脉痉挛引起的血管腔阻塞或狭窄，导致心肌缺血、缺氧或坏死，临床发病率和死亡率较高。有研究发现，脂质过氧化损伤和炎症反应在心肌缺血性损伤的发生发展中起着关键作用[4-5]。当机体缺血缺氧时可以诱发体内氧自由基代谢失衡，对机体产生破坏性病理改变。体内堆积过量氧自由基时可引起蛋白、脂质及DNA损伤，并能够诱发炎症反应[6-7]。魏娜等[8]研究发现，结扎左冠状动脉前降支建立大鼠心肌梗死模型后，模型组大鼠心功能明显受损，血清中抗氧化物酶的活性降低，脂质过氧化物含量升高，且炎症因子含量升高。在缺血过程中诱发的氧化应激反应，生成大量活性氧（ROS）并直接损伤心肌，同时炎症级联反应可进一步促进ROS的生成，加重损伤[9]。MDA是机体内脂质过氧化后产生的活性氧自由基基团，是缺血性损伤的重要衡量指标。SOD是还原酶类，能清除机体内氧自由基，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着非常关键的作用。王勇等[10]研究发现，冠心病心肌缺血血瘀证中，氧化应激损伤反应贯了血瘀证的始终，氧化应激关键分子超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、细胞色素C（Cyto C）等浓度变化趋势与氧化应激损伤程度一致。因此，以氧化应激为靶点，寻找有效抗心肌缺血性损伤药物成为可能。灵芝为传统中药，具有2000多年的药用历史，主要成分有灵芝多糖、生物碱、蛋白酶类、三萜类等，药用价值非常广泛[11-12]。游育红等[13]研究发现灵芝多糖可以抑制氧自由基对细胞器的损伤，对细胞凋亡、细胞坏死也有很好的疗效。胡太平等[14]研究证明了，在血管壁中产生O2的NHDPH氧化酶酶系的活性受到灵芝多糖的抑制。Jia等[15]研究发现灵芝多糖可以使大鼠体内抗氧化酶量、胰岛素量有明显升高，脂质过氧化作用和血糖含量明显下降，表明其可作为一种有效的抗氧化物。本实验以灵芝孢子粉按2.5g/kg灌胃给药3周，再行大鼠左冠状动脉前降支结扎建立心肌缺血模型后，继续给药1周。经取材测定心肌梗死面积及血清SOD活性和MDA含量变化后，发现灵芝孢子粉治疗组同模型组比较，能够缩小心肌缺血大鼠的心肌梗死面积，同时能升高血清SOD活性降低MDA含量，均具有统计学意义。提示了灵芝孢子粉对心肌缺血具有保护性作用，其机制可能通过抗脂质过氧化反应发挥效应。 [参考文献]
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[8] 魏娜，袁丁，徐媛青，等.竹节参总皂苷对大鼠心肌梗死的保护作用[J].中药药理与临床，2013，29（3）：75-78.
[9] Zhang N，Andresen BT，Zhang C.Inflammation and reactive oxygen species in cardiovascular disease[J].World J Cardiol，2010，2（12）：408-410.
[10] 王勇，王思轩，李春，等.氧化应激损伤反应在冠心病心肌缺血血瘀证中的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2011，17（1）：58-60.
[11] 叶鹏飞，张美萍，王康宇，等.灵芝主要成分及其药理作用的研究进展综述[J].食用药菌，2013，21（3）：158-161.
[12] 杨锦生.灵芝主要化学成分及其药理作用研究述评[J].中华中医药学刊，2012，30（4）：906-907.
[13] 游育红，林志彬.灵芝多糖肽对ECV304细胞氧化损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007，23（11）：1510-1513.
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[15] Jie Jia，Xi Zhang，Yong ShanHu，et a1.Evaluation of in vivo antioxidant activities of Canoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats[J].Food Chemistry，2009，115（1）：32.
（收稿日期：2013-09-26）