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摘要：目的：研究死亡相关蛋白激酶（DAPK）在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达，并通过去甲基化药物5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-CdR）的干预，研究DAPK甲基化状态以及表达水平的改变，探讨卵巢癌可能的发病机理，为临床探索卵巢癌治疗的新途径提供实验和理论基础。 方法：（1）采用逆转录PCR（RT-PCR）技术检测用药前后DAPK mRNA在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达水平。 （2）采用甲基化特异性PCR（MSP）方法观察用药前后DAPK基因甲基化状态的改变。 结果：（1）未经5-aza-CdR处理的OVCAR-3细胞中DAPK mRNA不表达，经5×10-8mol/L 5-aza-CdR作用后DAPK mRNA表达量为0.098±0.017，并随浓度增加逐渐增强（P<0.01），浓度为10-5mol/L时DAPK mRNA表达量为0.471±0.023。（2）未经5-aza-CdR处理的OVCAR-3细胞完全甲基化；经5×10-8mol/L 5-aza-CdR处理后，甲基化的DAPK基因部分去甲基化；经10-5mol/L 5-aza-CdR处理后，甲基化的DAPK基因完全去甲基化。 结论：甲基化是DAPK表达失活的重要原因。5-aza-CdR通过不同程度逆转启动子区甲基化而恢复DAPK表达与基因转录。
关键词：卵巢肿瘤；死亡相关蛋白激酶；甲基化
卵巢癌是女性生殖道常见的肿瘤之一，发病率居女性生殖系统恶性肿瘤第三位， 但其死亡率居妇科恶性肿瘤之首[1]，导致卵巢癌发病机理至今仍不清楚。死亡相关蛋白激酶（DAPK）是一种新的钙离子/钙调蛋白调节的丝/苏氨酸激酶，被认为是肿瘤的抑制剂，其5’非翻译区（5’ untranslated region，5’ UTR）的CpG岛是一个甲基化的潜在靶点，DNA甲基化的最终结果是使内源性DAPK基因转录沉默而失去基因的抑癌功能。本研究对卵巢癌细胞株OVCAR-3在体外用药物5-aza-CdR进行干预，检测DAPK基因启动子区CpG岛甲基化水平，探讨去甲基化对卵巢癌DAPK基因恢复转录、表达的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞株和主要试剂 人卵巢癌OVCAR-3细胞由复旦大学妇产科研究所馈赠。5-aza-CdR购于Sigma公司。DNA marker，逆转录试剂盒，Dntp，Taq酶，Wizard DNA clear-up system均购于美国Promega公司。
1.2实验分组 A组空白对照组（不加药），实验组按5-aza-CdR药物浓度分为B组（5×10-8mol/L），C组（10-7mol/L），D组（10-6mol/L）和E组（10-5mol/L）。
1.3逆转录PCR（RT-PCR）反应 按照Trizol法提取步骤，采用M-MuLV反转录酶反转录成cDNA。β-actin mRNA（520bp）引物5’-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3’ （上游），5’-CAG TGT GTT GCG TAC AGG T-3’ （下游），DAPK mRNA （172bp）引物 5’-GCC TGG AGA CGG AGA AGA-3’（ 上游）5’-AAG TCC CGT GGC TGG TAG-3’ （下游）。
1.4甲基化特异性PCR（MSP）反应 将A组和E组的细胞分别提取DNA，进行亚硫酸氢盐修饰和纯化，按照试剂说明的步骤进行扩增。甲基化DAPK（98bp）引物5’-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3’ （上游），5’-CCC TCC CAA ACG CCG A-3’ （下游），未甲基化DAPK（106bp）引物5’-GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3’ （上游），5’-CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3’ （下游）。
1.5 统计学处理 实验结果用均数±标准差表示（ ），数据用Stata7.0统计软件进行单因素方差分析、两两比较以及方差齐性检验。以P<0.05有统计学意义。
2.结果
2.1 OVCAR-3细胞系中DAPK mRNA表达情况及5-aza-CdR处理后的影响
RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳如图1所示，各组在520bp（β-actin）的位置均出现电泳条带。A组在172bp的位置没有出现电泳条带， B、C、D、E组在172bp的位置均出现了电泳条带，且条带的亮度由淡逐渐变亮。
图1、5-aza-CdR对OVCAR-3细胞系中DAPK mRNA
表达的影响
A组（空白对照组）；B组（5×10-8mol/L）；C组（10-7mol/L）；D组（10-6mol/L）；E组（10-5mol/L）
DAPK mRNA的相对表达量见表一。A组DAPK mRNA相对表达量为0， B组相对表达量为0.098±0.017，C组相对表达量为0.153±0.014，D组相对表达量为0.317±0.020，E组相对表达量为0.471±0.023。各实验组与对照组两两比较，P值均<0.01，差异有统计学意义。各实验组组间进行比较，P值均<0.01，差异有统计学意义。
表一、DAPK mRNA的相对表达量：DAPK/β-actin（%，）
各实验组与对照组两两比较，P值均<0.01；**各实验组组间进行比较，P值均<0.01
由上提示未经5-aza-CdR处理的OVCAR-3细胞DAPK mRNA不表达，经5-aza-CdR处理后有DAPK mRNA的表达，且表达随5-aza-CdR浓度增高而增强，呈剂量依赖关系。
2.2 5-aza-CdR对OVCAR-3细胞中DAPK基因甲基化状态的影响 见图2：
图2、5-aza-CdR对OVCAR-3细胞中DAPK
基因甲基化状态的影响
A：对照组；B：5×10-8mol/L组；E：10-5mol/L组；m：甲基化产物（扩增片段为98bp）；u：非甲基化产物（扩增片段为106bp）
由图2可见：未经药物处理的OVCAR-3细胞中DAPK基因与甲基化特异性引物（MP）扩增出相应长度的片段，但非甲基化特异性引物（UMP）未扩增出相应长度的片段，提示DAPK基因启动子区是甲基化的，仅有甲基化的产物；经5×10-8mol/L浓度5-aza-CdR处理后，非甲基化特异性引物（UMP）扩增出相应长度的片段，甲基化特异性引物（MP）也扩增出相应长度的片段，提示甲基化和非甲基化的DNA序列均存在，即甲基化的DAPK基因被部分去甲基化。经10-5 mol/L浓度5-aza-CdR处理后，非甲基化特异性引物（UMP）扩增出相应长度的片段，但甲基化特异性引物（MP）未扩增出相应长度的片段，说明DAPK基因启动子区是非甲基化的，仅有非甲基化的产物。
3.讨论
研究发现DAPK广泛参与包括p53、TNF-α、Fas、IFN-γ、TGF-β[2]等多种细胞凋亡因子介导的细胞凋亡途径，抑制肿瘤形成，被视为肿瘤抑制物。Bai T等[3]研究女性子宫及卵巢癌细胞系时发现，5种卵巢癌细胞系中DAPK表达均减少，其中有2种细胞系中DAPK基因表达明显减少。Collins Y等[4]通过对卵巢癌中DAPK甲基化水平的研究，发现正常个体基因组DNA中DAPK未发生甲基化，经过转化的正常的卵巢上皮细胞株也未发生DAPK的甲基化，2种卵巢癌细胞系DAPK发生了甲基化，30例卵巢癌患者组织样本67%DAPK发生甲基化，外周血有87%发现也存在DAPK的甲基化。
在哺乳动物基因的启动子区域区有40%包含CpG岛，如果这些区域甲基化，将会导致该基因的转录沉寂。抑癌基因甲基化，被认为是人类癌症发生早期的一个特征。5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytine，5-aza-CdR）为一种嘧啶核苷类似物，在DNA复制过程中，可以与DNA甲基转移酶（DNMT）结合形成一种共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，而达到去甲基化，使多种因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，恢复抑癌基因的功能，抑制肿瘤细胞的生长而达到治疗肿瘤的目的[5]。目前通过对乳腺癌细胞株、非小细胞肺癌细胞株等多种癌细胞株的研究发现[6-8]，5-aza-CdR可通过诱导细胞凋亡、诱导肿瘤相关抗原以及与DNMT共价结合降低活性等方式抑制肿瘤细胞的生长。
本研究的结果显示在卵巢癌细胞株OVCAR-3中DAPK mRNA不表达，与国外Bai T等[6]的报道一致。用不同浓度5-aza-CdR处理后DAPK mRNA均有表达（P<0.01），且表达强度随药物浓度的增加而增强（P<0.01）。该实验提示DAPK mRNA在卵巢癌细胞株OVCAR-3表达缺失，5-aza-CdR能够恢复DAPK mRNA的表达，并具有剂量依赖。
甲基化特异性PCR（methylation specific poly- merase chain reaction，MSP）技术[9]利用亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板，设计两对分别针对于甲基化与非甲基化等位基因的特异引物，在适当条件下进行PCR扩增，通过常规DNA琼脂糖凝胶电泳中是否出现相应特异性条带来判断该标本是否存在甲基化。目前，MSP技术已成为检测DNA甲基化最广泛使用的技术，该法简便，易行，灵敏度高，对DNA的质和量要求也低，能用于微量的DNA甲基化分析。目前唯一能提供比MSP更直接的甲基化分析技术是基因组测序法。然而，与之相比，MSP技术具有简便快速、灵敏度高和勿需使用昂贵的测序试剂及同位素等优点。
本实验MSP法检测未经药物处理的OVCAR-3细胞中DAPK基因启动子区是甲基化的，仅有甲基化的产物；经5×10-8mol/L浓度5-aza-CdR处理后DAPK基因甲基化和非甲基化产物均存在；经10-5 mol/L浓度5-aza-CdR处理后DAPK基因仅有甲基化的产物。
本实验说明DNA甲基化是OVCAR-3细胞中DAPK基因表达失活的重要原因，而且通过基因的去甲基化完全有可能使其重新表达，这一发现为肿瘤的表基因治疗提供了理论依据。5-aza-CdR通过不同程度地逆转DAPK基因基因甲基化而恢复DAPK mRNA的表达，有望成为新的抗肿瘤药物。
参考文献：
1 Siegel R， Naishadham D， Jemal A. Cancer statistics， 2012. CA Cancer J Clin. 2012. 62（1）： 10-29.
2 Schueter N， Krieglstein K. Mechanisms of TGF-β-mediated apoptosis . Cell Tissue Res， 2002， 307：1-14
3 Bai T， Tanaka T， Yukawa K， et al. Reduced expression of death- associated protein kinase in human uterine and ovarian carcinoma cells. Oncol Rep， 2004， 11（3）：661-665
4 Collins Y， Dicioccio R， Keitz B， et al. Methylation of death- associated protein kinase in ovarian carcinomas. Int J Gynecol Cancer， 2006， 16 （1）：195-199
5 Christman JK. 5-Aza-cytidine and 5-aza-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation： mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene， 2002， 21（35）：5483-5495
6 Yang Q，Shan L，Yoshimura G， et al. 5-aza-2’-deoxycytidine induces retinoic acid receptor beta 2 demethylation，cell cycle arrest and growth inhibition in breast carcinoma cells. Anticancer Res， 2002， 22（5）：2753-2756
7 Weiser TS， Ohnmacht GA， Guo ZS， et al. Induction of MAGE-3 expression in lung and esophageal cancer cells. Ann Thorac Surg， 2001， 71（1）：295-301
8 Robert MF， Morin S， Beaulieu N， et al. DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. NatGenet， 2003， 33（1）：61-65
9 Herman JG， Graff JR， Myohanen S， et al. Methylation-specific PCR： a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Ac- ad Sci U S A， 2006 ， 93（18）：9821-9826
关键词：卵巢肿瘤；死亡相关蛋白激酶；甲基化
卵巢癌是女性生殖道常见的肿瘤之一，发病率居女性生殖系统恶性肿瘤第三位， 但其死亡率居妇科恶性肿瘤之首[1]，导致卵巢癌发病机理至今仍不清楚。死亡相关蛋白激酶（DAPK）是一种新的钙离子/钙调蛋白调节的丝/苏氨酸激酶，被认为是肿瘤的抑制剂，其5’非翻译区（5’ untranslated region，5’ UTR）的CpG岛是一个甲基化的潜在靶点，DNA甲基化的最终结果是使内源性DAPK基因转录沉默而失去基因的抑癌功能。本研究对卵巢癌细胞株OVCAR-3在体外用药物5-aza-CdR进行干预，检测DAPK基因启动子区CpG岛甲基化水平，探讨去甲基化对卵巢癌DAPK基因恢复转录、表达的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞株和主要试剂 人卵巢癌OVCAR-3细胞由复旦大学妇产科研究所馈赠。5-aza-CdR购于Sigma公司。DNA marker，逆转录试剂盒，Dntp，Taq酶，Wizard DNA clear-up system均购于美国Promega公司。
1.2实验分组 A组空白对照组（不加药），实验组按5-aza-CdR药物浓度分为B组（5×10-8mol/L），C组（10-7mol/L），D组（10-6mol/L）和E组（10-5mol/L）。
1.3逆转录PCR（RT-PCR）反应 按照Trizol法提取步骤，采用M-MuLV反转录酶反转录成cDNA。β-actin mRNA（520bp）引物5’-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3’ （上游），5’-CAG TGT GTT GCG TAC AGG T-3’ （下游），DAPK mRNA （172bp）引物 5’-GCC TGG AGA CGG AGA AGA-3’（ 上游）5’-AAG TCC CGT GGC TGG TAG-3’ （下游）。
1.4甲基化特异性PCR（MSP）反应 将A组和E组的细胞分别提取DNA，进行亚硫酸氢盐修饰和纯化，按照试剂说明的步骤进行扩增。甲基化DAPK（98bp）引物5’-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3’ （上游），5’-CCC TCC CAA ACG CCG A-3’ （下游），未甲基化DAPK（106bp）引物5’-GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3’ （上游），5’-CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3’ （下游）。
1.5 统计学处理 实验结果用均数±标准差表示（ ），数据用Stata7.0统计软件进行单因素方差分析、两两比较以及方差齐性检验。以P<0.05有统计学意义。
2.结果
2.1 OVCAR-3细胞系中DAPK mRNA表达情况及5-aza-CdR处理后的影响
RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳如图1所示，各组在520bp（β-actin）的位置均出现电泳条带。A组在172bp的位置没有出现电泳条带， B、C、D、E组在172bp的位置均出现了电泳条带，且条带的亮度由淡逐渐变亮。
图1、5-aza-CdR对OVCAR-3细胞系中DAPK mRNA
表达的影响
A组（空白对照组）；B组（5×10-8mol/L）；C组（10-7mol/L）；D组（10-6mol/L）；E组（10-5mol/L）
DAPK mRNA的相对表达量见表一。A组DAPK mRNA相对表达量为0， B组相对表达量为0.098±0.017，C组相对表达量为0.153±0.014，D组相对表达量为0.317±0.020，E组相对表达量为0.471±0.023。各实验组与对照组两两比较，P值均<0.01，差异有统计学意义。各实验组组间进行比较，P值均<0.01，差异有统计学意义。
表一、DAPK mRNA的相对表达量：DAPK/β-actin（%，）
各实验组与对照组两两比较，P值均<0.01；**各实验组组间进行比较，P值均<0.01
由上提示未经5-aza-CdR处理的OVCAR-3细胞DAPK mRNA不表达，经5-aza-CdR处理后有DAPK mRNA的表达，且表达随5-aza-CdR浓度增高而增强，呈剂量依赖关系。
2.2 5-aza-CdR对OVCAR-3细胞中DAPK基因甲基化状态的影响 见图2：
图2、5-aza-CdR对OVCAR-3细胞中DAPK
基因甲基化状态的影响
A：对照组；B：5×10-8mol/L组；E：10-5mol/L组；m：甲基化产物（扩增片段为98bp）；u：非甲基化产物（扩增片段为106bp）
由图2可见：未经药物处理的OVCAR-3细胞中DAPK基因与甲基化特异性引物（MP）扩增出相应长度的片段，但非甲基化特异性引物（UMP）未扩增出相应长度的片段，提示DAPK基因启动子区是甲基化的，仅有甲基化的产物；经5×10-8mol/L浓度5-aza-CdR处理后，非甲基化特异性引物（UMP）扩增出相应长度的片段，甲基化特异性引物（MP）也扩增出相应长度的片段，提示甲基化和非甲基化的DNA序列均存在，即甲基化的DAPK基因被部分去甲基化。经10-5 mol/L浓度5-aza-CdR处理后，非甲基化特异性引物（UMP）扩增出相应长度的片段，但甲基化特异性引物（MP）未扩增出相应长度的片段，说明DAPK基因启动子区是非甲基化的，仅有非甲基化的产物。
3.讨论
研究发现DAPK广泛参与包括p53、TNF-α、Fas、IFN-γ、TGF-β[2]等多种细胞凋亡因子介导的细胞凋亡途径，抑制肿瘤形成，被视为肿瘤抑制物。Bai T等[3]研究女性子宫及卵巢癌细胞系时发现，5种卵巢癌细胞系中DAPK表达均减少，其中有2种细胞系中DAPK基因表达明显减少。Collins Y等[4]通过对卵巢癌中DAPK甲基化水平的研究，发现正常个体基因组DNA中DAPK未发生甲基化，经过转化的正常的卵巢上皮细胞株也未发生DAPK的甲基化，2种卵巢癌细胞系DAPK发生了甲基化，30例卵巢癌患者组织样本67%DAPK发生甲基化，外周血有87%发现也存在DAPK的甲基化。
在哺乳动物基因的启动子区域区有40%包含CpG岛，如果这些区域甲基化，将会导致该基因的转录沉寂。抑癌基因甲基化，被认为是人类癌症发生早期的一个特征。5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytine，5-aza-CdR）为一种嘧啶核苷类似物，在DNA复制过程中，可以与DNA甲基转移酶（DNMT）结合形成一种共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，而达到去甲基化，使多种因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，恢复抑癌基因的功能，抑制肿瘤细胞的生长而达到治疗肿瘤的目的[5]。目前通过对乳腺癌细胞株、非小细胞肺癌细胞株等多种癌细胞株的研究发现[6-8]，5-aza-CdR可通过诱导细胞凋亡、诱导肿瘤相关抗原以及与DNMT共价结合降低活性等方式抑制肿瘤细胞的生长。
本研究的结果显示在卵巢癌细胞株OVCAR-3中DAPK mRNA不表达，与国外Bai T等[6]的报道一致。用不同浓度5-aza-CdR处理后DAPK mRNA均有表达（P<0.01），且表达强度随药物浓度的增加而增强（P<0.01）。该实验提示DAPK mRNA在卵巢癌细胞株OVCAR-3表达缺失，5-aza-CdR能够恢复DAPK mRNA的表达，并具有剂量依赖。
甲基化特异性PCR（methylation specific poly- merase chain reaction，MSP）技术[9]利用亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板，设计两对分别针对于甲基化与非甲基化等位基因的特异引物，在适当条件下进行PCR扩增，通过常规DNA琼脂糖凝胶电泳中是否出现相应特异性条带来判断该标本是否存在甲基化。目前，MSP技术已成为检测DNA甲基化最广泛使用的技术，该法简便，易行，灵敏度高，对DNA的质和量要求也低，能用于微量的DNA甲基化分析。目前唯一能提供比MSP更直接的甲基化分析技术是基因组测序法。然而，与之相比，MSP技术具有简便快速、灵敏度高和勿需使用昂贵的测序试剂及同位素等优点。
本实验MSP法检测未经药物处理的OVCAR-3细胞中DAPK基因启动子区是甲基化的，仅有甲基化的产物；经5×10-8mol/L浓度5-aza-CdR处理后DAPK基因甲基化和非甲基化产物均存在；经10-5 mol/L浓度5-aza-CdR处理后DAPK基因仅有甲基化的产物。
本实验说明DNA甲基化是OVCAR-3细胞中DAPK基因表达失活的重要原因，而且通过基因的去甲基化完全有可能使其重新表达，这一发现为肿瘤的表基因治疗提供了理论依据。5-aza-CdR通过不同程度地逆转DAPK基因基因甲基化而恢复DAPK mRNA的表达，有望成为新的抗肿瘤药物。
参考文献：
1 Siegel R， Naishadham D， Jemal A. Cancer statistics， 2012. CA Cancer J Clin. 2012. 62（1）： 10-29.
2 Schueter N， Krieglstein K. Mechanisms of TGF-β-mediated apoptosis . Cell Tissue Res， 2002， 307：1-14
3 Bai T， Tanaka T， Yukawa K， et al. Reduced expression of death- associated protein kinase in human uterine and ovarian carcinoma cells. Oncol Rep， 2004， 11（3）：661-665
4 Collins Y， Dicioccio R， Keitz B， et al. Methylation of death- associated protein kinase in ovarian carcinomas. Int J Gynecol Cancer， 2006， 16 （1）：195-199
5 Christman JK. 5-Aza-cytidine and 5-aza-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation： mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene， 2002， 21（35）：5483-5495
6 Yang Q，Shan L，Yoshimura G， et al. 5-aza-2’-deoxycytidine induces retinoic acid receptor beta 2 demethylation，cell cycle arrest and growth inhibition in breast carcinoma cells. Anticancer Res， 2002， 22（5）：2753-2756
7 Weiser TS， Ohnmacht GA， Guo ZS， et al. Induction of MAGE-3 expression in lung and esophageal cancer cells. Ann Thorac Surg， 2001， 71（1）：295-301
8 Robert MF， Morin S， Beaulieu N， et al. DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. NatGenet， 2003， 33（1）：61-65
9 Herman JG， Graff JR， Myohanen S， et al. Methylation-specific PCR： a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Ac- ad Sci U S A， 2006 ， 93（18）：9821-9826