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【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2015）3
[摘要] 目的 探讨紫外线能否诱导活化活化CD4+T细胞免疫原性凋亡。方法 紫外线照射抗原刺激活化的小鼠卵清蛋白（OVA）特异的CD4+T细胞，流式细胞术检测细胞膜上钙网蛋白（CRT）表达； PI检测死亡状态。结果 紫外线照射可诱导OVA-T细胞膜异位表达CRT、ERp57，且CRT表达早于调亡细胞特征性标志PS表达。结论 紫外线可诱导活化活化CD4+T细胞免疫原性凋亡。
[关键词] 免疫原性凋亡；钙网蛋白；抗原特异性T细胞
静脉注射射线照射的CD4+自身反应T细胞（T细胞疫苗，TCV）可诱导机体产生特异性的抗T细胞调节性免疫反应[1-2]。TCV已成功应用于多发性硬化症、佐剂性关节炎、糖尿病等多种自身免疫病的治疗[2]。然而，为什么射线照射的CD4+自身反应T细胞具有诱导机体产生负相调节免疫应答的能力还不清楚。本研究以CD4+小鼠卵清蛋白（OVA）特异的T细胞为模型探讨TCV诱导调节性免疫应答的机制。
1 材料与方法
1.1 鼠
雌性6～8周龄的BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心。
1.2 主要试剂
兔抗鼠CRT、ERp57抗体（R&D Systems 公司，美国）；兔IgG1同型对照抗体（BD 公司，美国）。 PI购于Sigma公司。
1.3 免疫原性凋亡诱导
OVA特异T细胞由本实验室制备并保存。以OVA为抗原体外刺激OVA-T 48-72h，通过形态学观察及CD25检测确认活化状态。活化的OVA-T以UV照射诱导免疫原性凋亡。
1.4 流式细胞仪检测OVA-T表面CRT表达
分别于照射后0、1、4h收集活化的OVA-T， 1 000 r/min 离心4 min，弃上清，PBS 溶液洗涤细胞2 次，然后将细胞离心（1 000 r/min，4 min），PBS 重悬至细胞密度为4 x106 个/ ml， 取25 μl（1 x105 个细胞）于10 ml EP 管中，加10 μl 兔抗鼠CRT-FITC，4℃避光孵育30 min。最后，将细胞离心（1 000 r/min，4 min），弃上清，去除未结合的荧光抗体，PBS 重悬细胞至300 μl。将同源对照抗体以同样的方法标记细胞。美国BD 公司FACSAria 流式细胞仪检测。
1.5 凋亡检测
分别于照射后0、1、4h收集活化的OVA-T，根据Annexin V FITC/PI 试剂盒说明书操作， 流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 UV照射的OVA-T表面异位表达CRT
流式分析显示，UV照射可诱导活化的OVA-T细胞表面表达CRT，具有免疫原性凋亡细胞特征（图1）。
2.2 UV 照射诱导活化T细胞免疫原性凋亡
为检测射线照对活化T细胞活性的影响，我们采用CRT-FITC/PI双染法检测CRT表达与细胞死亡状态的关系。结果显示，UV照射4h后CRT表达显著上升，但大多数细胞PI结果为阴性，说明细胞膜仍保持完整状态（图2）。以上结果表明，UV照射可诱导活化T细胞免疫原性凋亡。
3 讨论
致病性自身反应性T细胞可造成组织损伤，诱发T细胞介导的自身免疫性疾病，其灭活后可作为疫苗用于自身免疫性疾病防治，这一过程与传统预防感染性疾病的疫苗相似，故称为T 细胞疫苗接种（TCV）[3]。迄今为止，TCV已成功用于多发性硬化症、佐剂性关节炎、糖尿病及自身免疫性肾小球肾炎的治疗。另外，TCV还可抑制移植排斥反应，延长同种异体移植物存活。然而，为什么照射后的自身反应T细胞具有诱导机体产生特异性免疫应答的机制仍不清楚。我们推测这可能与射线照射诱导自身反应T细胞发生某种表型、功能的变化，从而赋予其诱导机体免疫应答的能力。有研究表明，射线照射的肿瘤细胞可发生免疫原性凋亡，使其具有诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫的能力。这主要与免疫原性凋亡的肿瘤细胞膜异位表达CRT等蛋白有关。
CRT钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是一种在结构和功能上高度保守的钙结合蛋白，主要存在于内质网，作为分子伴侣，参与抗原提呈。然而，近年大量研究发现，CRT亦可异位表达于细胞膜上。如凋亡的细胞表面可上调表达CRT，可作为 “吞噬信号”促进树突细胞等吞噬细胞对凋亡的细胞的吞噬清除。
本研究中，我们发现UV照射活化的T细胞可表达CRT，且CRT表达早于凋亡特征性标志PS，说明活化T细胞亦可发生免疫原性凋亡。这提示，TCV之所以具有诱导特异性免疫应答的能力与其细胞膜异位表达CRT，促进DC对T细胞的吞噬，进而提呈TCR，启动调节性免疫应答有关。
综上所述，我们的研究表明，射线照射可诱导活化的T细胞免疫原性凋亡并异位表达CRT。当然，CRT的表达如何影响TCV的免疫原性有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Volovitz I， Marmor Y， Mor F， et al. T cell vaccination induces the elimination of EAE effector T cells： analysis using GFP-transduced， encephalitogenic T cells[J]. J Autoimmun， 2010， 35 （2）：135-144.
[2] Li S， Niu X， Xi Y， et al. T cell vaccination inhibits Th1/Th17/Tfh frequencies and production of autoantibodies in collagen-induced arthritis[J]. Clin Dev Immunol， 2013， 2013 967301.
[3] Trivedi S， Zang Y， Culpepper S， et al. T cell vaccination therapy in an induced model of anti-RNP autoimmune glomerulonephritis[J]. Clin Immunol， 2010， 137 （2）：281-287.
[摘要] 目的 探讨紫外线能否诱导活化活化CD4+T细胞免疫原性凋亡。方法 紫外线照射抗原刺激活化的小鼠卵清蛋白（OVA）特异的CD4+T细胞，流式细胞术检测细胞膜上钙网蛋白（CRT）表达； PI检测死亡状态。结果 紫外线照射可诱导OVA-T细胞膜异位表达CRT、ERp57，且CRT表达早于调亡细胞特征性标志PS表达。结论 紫外线可诱导活化活化CD4+T细胞免疫原性凋亡。
[关键词] 免疫原性凋亡；钙网蛋白；抗原特异性T细胞
静脉注射射线照射的CD4+自身反应T细胞（T细胞疫苗，TCV）可诱导机体产生特异性的抗T细胞调节性免疫反应[1-2]。TCV已成功应用于多发性硬化症、佐剂性关节炎、糖尿病等多种自身免疫病的治疗[2]。然而，为什么射线照射的CD4+自身反应T细胞具有诱导机体产生负相调节免疫应答的能力还不清楚。本研究以CD4+小鼠卵清蛋白（OVA）特异的T细胞为模型探讨TCV诱导调节性免疫应答的机制。
1 材料与方法
1.1 鼠
雌性6～8周龄的BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心。
1.2 主要试剂
兔抗鼠CRT、ERp57抗体（R&D Systems 公司，美国）；兔IgG1同型对照抗体（BD 公司，美国）。 PI购于Sigma公司。
1.3 免疫原性凋亡诱导
OVA特异T细胞由本实验室制备并保存。以OVA为抗原体外刺激OVA-T 48-72h，通过形态学观察及CD25检测确认活化状态。活化的OVA-T以UV照射诱导免疫原性凋亡。
1.4 流式细胞仪检测OVA-T表面CRT表达
分别于照射后0、1、4h收集活化的OVA-T， 1 000 r/min 离心4 min，弃上清，PBS 溶液洗涤细胞2 次，然后将细胞离心（1 000 r/min，4 min），PBS 重悬至细胞密度为4 x106 个/ ml， 取25 μl（1 x105 个细胞）于10 ml EP 管中，加10 μl 兔抗鼠CRT-FITC，4℃避光孵育30 min。最后，将细胞离心（1 000 r/min，4 min），弃上清，去除未结合的荧光抗体，PBS 重悬细胞至300 μl。将同源对照抗体以同样的方法标记细胞。美国BD 公司FACSAria 流式细胞仪检测。
1.5 凋亡检测
分别于照射后0、1、4h收集活化的OVA-T，根据Annexin V FITC/PI 试剂盒说明书操作， 流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 UV照射的OVA-T表面异位表达CRT
流式分析显示，UV照射可诱导活化的OVA-T细胞表面表达CRT，具有免疫原性凋亡细胞特征（图1）。
2.2 UV 照射诱导活化T细胞免疫原性凋亡
为检测射线照对活化T细胞活性的影响，我们采用CRT-FITC/PI双染法检测CRT表达与细胞死亡状态的关系。结果显示，UV照射4h后CRT表达显著上升，但大多数细胞PI结果为阴性，说明细胞膜仍保持完整状态（图2）。以上结果表明，UV照射可诱导活化T细胞免疫原性凋亡。
3 讨论
致病性自身反应性T细胞可造成组织损伤，诱发T细胞介导的自身免疫性疾病，其灭活后可作为疫苗用于自身免疫性疾病防治，这一过程与传统预防感染性疾病的疫苗相似，故称为T 细胞疫苗接种（TCV）[3]。迄今为止，TCV已成功用于多发性硬化症、佐剂性关节炎、糖尿病及自身免疫性肾小球肾炎的治疗。另外，TCV还可抑制移植排斥反应，延长同种异体移植物存活。然而，为什么照射后的自身反应T细胞具有诱导机体产生特异性免疫应答的机制仍不清楚。我们推测这可能与射线照射诱导自身反应T细胞发生某种表型、功能的变化，从而赋予其诱导机体免疫应答的能力。有研究表明，射线照射的肿瘤细胞可发生免疫原性凋亡，使其具有诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫的能力。这主要与免疫原性凋亡的肿瘤细胞膜异位表达CRT等蛋白有关。
CRT钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是一种在结构和功能上高度保守的钙结合蛋白，主要存在于内质网，作为分子伴侣，参与抗原提呈。然而，近年大量研究发现，CRT亦可异位表达于细胞膜上。如凋亡的细胞表面可上调表达CRT，可作为 “吞噬信号”促进树突细胞等吞噬细胞对凋亡的细胞的吞噬清除。
本研究中，我们发现UV照射活化的T细胞可表达CRT，且CRT表达早于凋亡特征性标志PS，说明活化T细胞亦可发生免疫原性凋亡。这提示，TCV之所以具有诱导特异性免疫应答的能力与其细胞膜异位表达CRT，促进DC对T细胞的吞噬，进而提呈TCR，启动调节性免疫应答有关。
综上所述，我们的研究表明，射线照射可诱导活化的T细胞免疫原性凋亡并异位表达CRT。当然，CRT的表达如何影响TCV的免疫原性有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Volovitz I， Marmor Y， Mor F， et al. T cell vaccination induces the elimination of EAE effector T cells： analysis using GFP-transduced， encephalitogenic T cells[J]. J Autoimmun， 2010， 35 （2）：135-144.
[2] Li S， Niu X， Xi Y， et al. T cell vaccination inhibits Th1/Th17/Tfh frequencies and production of autoantibodies in collagen-induced arthritis[J]. Clin Dev Immunol， 2013， 2013 967301.
[3] Trivedi S， Zang Y， Culpepper S， et al. T cell vaccination therapy in an induced model of anti-RNP autoimmune glomerulonephritis[J]. Clin Immunol， 2010， 137 （2）：281-287.