论文部分内容阅读
当今全球的乙型肝炎病毒（HBV）感染者约为三亿，其感染率超过HIV100倍，其强大的传染能力导致世界上每年都有大量的人群被感染。由于该病毒具有共价闭合环状DNA（cccDNA）这一独特的复制形式[1]，导致一般抗病毒药物很难将其从患者体内完全清除，使得感染者肝炎经常复发，成为慢性乙型肝炎（CHB），并逐渐演变为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。每年世界上死于慢性乙型肝炎以及其进展而来的肝硬化、肝细胞癌的患者高达100多万。因此，寻找新的有效的抗HBV藥物并在监测下把感染者体内的病毒量控制在极低范围内甚至完全清除，是世界范围内众多医生以及科研工作者的共同目标与任务。在这样的背景下，第三代抗HBV药物恩替卡韦（Entecavir）诞生了，在乙型肝炎的临床治疗中显示了极大的优点和特点。
1.HBV cccDNA的分子结构及检测方法
1.1HBV cccDNA的形成特点
入侵肝细胞内的HBV在胞质中形成松弛环状DNA（rcDNA），其特点为能通过共价键与蛋白质结合，而且不论正链和负链都存在缺口，形成的是部分环状结构[2]。胞质中的rcDNA进入细胞核中，在核内酶的作用下，两条链上的缺口都被补齐，并经过一系列空间折叠，最终形成了具有超螺旋结构的共价闭合环状DNA（cccDNA）。形成的cccDNA作为模板合成mRNA，再以mRNA为模板合成负链DNA，同样以负链DNA为模板合成正链DNA，并与之前的负链DNA结合，形成新的rcDNA，补充到rcDNA库中。而此时rcDNA有两种去向：第一种是与蛋白质结合形成完整的HBV，逸出肝细胞并继续感染其他健康肝细胞：第二种是再次形成cccDNA，补充到cccDNA库中[3]。
1.2HBV cccDNA检测的临床意义
从HBV cccDNA的形成特点可以看出，它是HBV复制的特殊中间体，可与核内蛋白质形成微染色体，因具有不对称复制的特点从而避免被清除，从而成为HBV持续感染的关键因素，因此检测HBV cccDNA具有重要的临床意义。
1.2.1HBV cccDNA与 HBV DNA 及HBV表面标志物的关联
在以往诊断和疗效观察中，血清中HBV DNA和表面标志物是常用的检测指标。在覃亚勤的实验中，通过对156例慢性乙型肝炎（CHB）患者的检测，得出的结论是：①HBV DNA 与HBeAg双阳组中，cccDNA的阳性率与阴性率具有显著性差异（P<0.01）；②HBeAg阳性组中cccDNA水平较高，与阴性组具有显著性差异[4]。在李华东的实验中，得出肝细胞中HBV cccDNA与肝细胞HBsAg、HBcAg的表达模式差异则无统计学意义（P>0.05）[5]。
1.2.2HBV cccDNA与乙型肝炎病情关系
因为HBV cccDNA是HBV复制的中间体，故其复制强度可在一定强度上反映出乙肝患者的病情轻重程度[6]。HBV cccDNA由期前体rcDNA形成而来，存在于肝细胞中，其含量相当稳定。但是，当肝细胞由于HBV的感染及机体免疫的共同作用下而破裂时，肝细胞内的HBV cccDNA就会从肝细胞内释放出来进入血液中，而且在一定范围内，血液中的HBV cccDNA的含量代表了肝细胞的损伤程度，具有良好的相关性。[7]此外，有学者认为，当血清中HBsAg由阳性转阴时，并不代表乙肝病情完全缓解，此时依然能够从肝细胞内检测出HBV cccDNA。因此用HBV cccDNA作为检测指标用于病情的早期诊断以及病情再复发的诊断[8]。
1.2.3HBV cccDNA作为抗病毒药物疗效的监测指标
抗HBV治疗可使肝组织内HBV cccDNA含量显著下降，虽然想要达到完全清除HBV相当困难，尽管如此，其作用靶点是核外松弛环状DNA（rcDNA），随着时间延长，肝细胞核内cccDNA来源减少甚至可以消失，当病毒复制速度极慢，且其复制周期长于肝细胞的生命周期时，HBV cccDNA池可能被耗竭。对于慢性乙型肝炎患者，不论HBeAg阳性还是阴性都必须长期规范治疗，最大限度使用抗病毒药物治疗[9]。
1.3肝细胞中的HBV cccDNA
尽管如前所述，检测血清中HBV cccDNA和表面标志物可以在一定程度反映肝细胞中cccDNA，但是仍然不够准确。张永乐通过对30乙肝患者的血清进行检测，认为：①血清中HBV DNA阳性或者HBeAg阳性并不能断定肝细胞中的HBV正在复制；②血清中HBV DNA阴性或者HBeAg阴性也不能认为肝细胞中的不存在HBV的复制；③只有通过直接检测肝细胞中HBV cccDNA才能证实肝细胞内是否有HBV cccDNA的复制，肝细胞HBV cccDNA检测才是较为准确和可靠的标准。[10]
1.4HBV cccDNA的检测方法
1.4.1Southern blot法
经典的分子生物学方法，成本低，但是操作者需要有较高的操作技术水平，而且灵敏度也较低。
1.4.2 PCR方法
A原理：主要利用rcDNA 与 cccDNA理化特性和结构的两点差异来进行分离与检测：①rcDNA两条链上都有缺口，能被某些特定的酶降解，而cccDNA两条链都是完整的，不会被降解；②rcDNA能以共价结合方式与蛋白质形成复合物，而cccDNA不能[11]。
常用方法：①普通PCR；②竞争PCR；③荧光实时定量PCR；④套式与半套式PCR；⑤侵入检查（Invader Asssay）[12]
1.4.3基因测序
2.恩替卡韦在乙型肝炎患者抗病毒作用
2.1 作用机制
作为最新的抗乙肝病毒一线药物，恩替卡韦（Enticavir）是一种环戊酰鸟苷类似物，在被吸收进入体内后通过磷酸化变成具有活性的三磷酸盐。该三磷酸盐对于HBV DNA聚合酶天然底物三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷具有竞争抑制作用，从而抑制HBV DNA聚合酶的形成。体外研究已经证明恩替卡韦三磷酸盐是通过作用于HBV聚合酶的三种活性而发挥抗病毒作用的：①乙肝病毒DNA聚合酶的启动阶段；②以前基因组mRNA为模板逆转录形成负链的过程；③以合成的负链为模板合成正链的过程。恩替卡韦三磷酸盐在细胞内的半衰期为15h，对HBV DNA聚合酶的抑制常数Ki为0.0012μM。 2.2 药代动力学
I：吸收。该药品吸收迅速，健康人群口服后0.5到1.5小时即可达到峰浓度（Cmax）。按照每天给药一次，则6—10天后体内血药浓度可达稳态，累积量约为2倍。
此外要注意食物对口服吸收有一定影响影响。有研究表明，如果在口服0.5mg该药物的同时进食标准高脂餐、低脂餐，会导致药物在吸收时表现为轻微延迟（约0.25h-0.75h），在峰浓度方面表现为Cmax降低了约44—46%，药时曲线下面积（AUC）约降低18—20%。鉴于此，该药物推荐空腹服用（如餐前或餐后至少2小时）。
II：结合。体外研究表明，恩替卡韦与人的血浆蛋白结合率为13%。
III：分布。恩替卡韦的表观分布容积（Vd）大于全身液体量，说明该药物能广泛分布于各种组织。
IV：代谢和清除。在人和大鼠实验中，服用14C标记的恩替卡韦后，未检测到该药物的氧化代谢物或乙酰化代谢物，但观察到有少量Ⅱ期代谢产物如葡萄糖醛酸苷结合物以及硫酸结合物。
在达到血浆峰浓度后，恩替卡韦的血药浓度以双指数方式下降，需128—149小时达到终末清除半衰期。药物累积指数约为每天一次给药剂量的2倍，这表明其有效累积半衰期约为24小时。
该药主要以原形的形式通过肾脏清除，既可以通过肾小球滤过也可以通过网状小管分泌，同时清除率（C）为给药量62—73%。肾清除率大约为360—471mL/min，且不依赖于给药剂量。
2.3 恩替卡韦对乙型肝炎的疗效
恩替卡韦通过作用于HBV DNA三种活性，从而对HBV复制具有抑制作用，其抑制作用表现在两个阶段：①快速清除期：从血浆区室中快速清除外周循环血中的病毒颗粒；②缓慢清除期：通过抑制病毒复制使肝细胞中的病毒得到有效清除。由于缓慢清除期的存在，所以乙肝患者需要抗乙肝病毒药物的长期治疗。
2.4 恩替卡韦的耐药性
临床研究表明，一个氨基酸置换就足以导致病毒对拉米夫定和阿德福韦酯产生耐药。而恩替卡韦在治疗乙肝的优势就表现在其低耐药性上：即至少需要三个不同的氨基酸都被置换才有可能导致病毒对恩替卡韦产生耐药性。
在超过500名患者的II期临床试验的记录中，只有2名患者出现了针对恩替卡韦的耐药现象，值得注意的是，这两名患者都是以往HBV治疗无效的，在进入研究之前已经存在了HBV耐药株[13]。
2.5 恩替卡韦与其他药物的相互作用
恩替卡韦并不是细胞色素P450（CYP450）酶系统的诱导剂、抑制剂以及底物，因此恩替卡韦的药代动力学并不受诱导或抑制细胞色素P450酶系统代谢的药物的影响。
恩替卡韦与拉米夫定、阿德福韦同时服用并不会产生明显的药物相互作用。恩替卡韦以原形的形式通过肾脏清除，因此同时服用其他通过肾脏清除或能够影响肾功的药物可能会影响恩替卡韦的清除，但是其相互作用尚未有研究。
3.恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA的影响
恩替卡韦是最新的抗乙肝病毒一线药物，其作用机制是抑制HBV DNA聚合酶的三种活性，更重要的是其潜在的耐药性有限，需要至少三个氨基酸置换才能发生耐药突变，这使得许多已经对阿德福韦酯和拉米夫定产生耐药的慢性乙肝患者可以继续进行有效的治疗[14]。恩替卡韦通过抑制HBV DNA聚合酶的三种活性，使得HBV DNA含量逐渐减少，其中rcDNA渐渐耗竭，导致cccDNA池也逐渐耗竭，含量降低至极低水平。只有病毒复制被有效抑制，肝炎病情才能得到有效控制。
在宋淑静等的实验中，通过对112例慢性乙型肝炎患者使用恩替卡韦治疗两年，比较治疗前后患者体内HBV cccDNA含量，得出以下结果：治疗2年后在所有112例患者的血清中全部检测不到HBV cccDNA，而患者肝细胞内HBV cccDNA与治疗之前相比虽有降低但是仅降低了一个数量级。得出的结论是，使用恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎，可以有效抑制HBV的复制，但是不能清除肝组织中的HBV cccDNA，停药后仍有病毒反弹的可能，因此需要长期使用[15]。
恩替卡韦先是在快速清除期清除外周循环中的病毒颗粒，然后在缓慢清除期清除肝细胞中的病毒颗粒。如果仅仅因为观察到外周血中HBV cccDNA含量降低而马上减少药量或者停药，会导致病情的反弹甚至引起急性重型肝炎，后果非常严重。所以，通过检测肝细胞中的HBV cccDNA可反映恩替卡韋的疗效，对于恩替卡韦的使用疗程、用量及药物配伍等均有重要的临床指导意义[16]。
参考文献：
[1]陈智。乙型肝炎病毒cccDNA研究现状。中华传染病杂志，2003，21（1）：8-10.
[2]张涛，高英堂。乙肝病毒cccDNA的研究进展。国外医学病毒学分册，2005，12（6）：161-165.
[3]C.Seeger，W.S.Masson，Hepatitis B virus biology.Microbiomoler.Biol.Rev[J]，2000：51-58.
[4]覃亚勤，赵登蕴，刘彦慧。慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBV DNA、HBeAg关系研究[J]。中国实验诊断学，2009，13（9）：1193-1195.
[5]李华东，江建宁，陆晖，等。慢性乙型肝炎患者肝细胞HBV cccDNA、tDNA及HBV表面标志物的相关性研究[J/CD]。中华实验和临床感染病杂志，2012，6（4）：300-303.
[6]李红，唐红。乙肝病毒cccDNA检测方法及临床意义的研究进展[J]。生物医学工程学杂志，2009，26（3）：662-665.
[7]孙水林，陈明发，郑小君，等。慢性乙型肝炎患者检测血清cccDNA的临床意义[J]。Chinese Journal of Clinnical Medicine，2009，16（4）：524-534. [8]Chen Y，Sze J，He ML.HBV cccDNA in patientssera as an indicator for HBV reactivation and an carly signal of liver damage[J].World J Gastroenterol，2004，10（1）：82-85.
[9]Kock j，Baumert TF，Delaney Wet，et al.Inhibitiory effect of adfovir and lamivudine on the initiation of hepatitis B virus infection inprimary tupaia hepatocytes.Hepatitis B Virus biology.Microb.Molec.Biol Rev，2000，64：51-58.
[10]张永乐，徐岱，等，乙肝患者肝组织中HBVcccDNA与血清中HBV DNA、HBeAg的关系[J]。医学研究杂志，2008，37（3）：60-61
[11]He ML，Wu j，Chen Y，et al.A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCR.Biochem Biophys Res Commum，2002，295：1102-7
[12]Wong DK，Yuen MF，Yuan H，et al.Quantitation of HBV cccDNA in Chronic Hepatitis B patients.Hepatology，2004，40：727-737.
[13]Anastasia Rivkin.A review of entecavir in the treatment of chronic hepatitis B infection（LianYong Yang）.Current Medcial Research And Opinion：Anastasia Rivkin，2005，1845-1856.
[14]Chang TT，Gish RG，de Man R，et al.A comparison of entecavir and lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].N Engl J Med，2006，354（10）：1001-1010.
[15]宋淑静，徐飞，刘亚楠，等。恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者HBV cccDNA的影响。山东医药，2011年，51（29）：80-81
[16]李菲菲，任万华，主余華，等。肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量与拉米夫定、阿德福韦疗程的关系[J].中华传染病杂志，2009，27（11）：690-692.
1.HBV cccDNA的分子结构及检测方法
1.1HBV cccDNA的形成特点
入侵肝细胞内的HBV在胞质中形成松弛环状DNA（rcDNA），其特点为能通过共价键与蛋白质结合，而且不论正链和负链都存在缺口，形成的是部分环状结构[2]。胞质中的rcDNA进入细胞核中，在核内酶的作用下，两条链上的缺口都被补齐，并经过一系列空间折叠，最终形成了具有超螺旋结构的共价闭合环状DNA（cccDNA）。形成的cccDNA作为模板合成mRNA，再以mRNA为模板合成负链DNA，同样以负链DNA为模板合成正链DNA，并与之前的负链DNA结合，形成新的rcDNA，补充到rcDNA库中。而此时rcDNA有两种去向：第一种是与蛋白质结合形成完整的HBV，逸出肝细胞并继续感染其他健康肝细胞：第二种是再次形成cccDNA，补充到cccDNA库中[3]。
1.2HBV cccDNA检测的临床意义
从HBV cccDNA的形成特点可以看出，它是HBV复制的特殊中间体，可与核内蛋白质形成微染色体，因具有不对称复制的特点从而避免被清除，从而成为HBV持续感染的关键因素，因此检测HBV cccDNA具有重要的临床意义。
1.2.1HBV cccDNA与 HBV DNA 及HBV表面标志物的关联
在以往诊断和疗效观察中，血清中HBV DNA和表面标志物是常用的检测指标。在覃亚勤的实验中，通过对156例慢性乙型肝炎（CHB）患者的检测，得出的结论是：①HBV DNA 与HBeAg双阳组中，cccDNA的阳性率与阴性率具有显著性差异（P<0.01）；②HBeAg阳性组中cccDNA水平较高，与阴性组具有显著性差异[4]。在李华东的实验中，得出肝细胞中HBV cccDNA与肝细胞HBsAg、HBcAg的表达模式差异则无统计学意义（P>0.05）[5]。
1.2.2HBV cccDNA与乙型肝炎病情关系
因为HBV cccDNA是HBV复制的中间体，故其复制强度可在一定强度上反映出乙肝患者的病情轻重程度[6]。HBV cccDNA由期前体rcDNA形成而来，存在于肝细胞中，其含量相当稳定。但是，当肝细胞由于HBV的感染及机体免疫的共同作用下而破裂时，肝细胞内的HBV cccDNA就会从肝细胞内释放出来进入血液中，而且在一定范围内，血液中的HBV cccDNA的含量代表了肝细胞的损伤程度，具有良好的相关性。[7]此外，有学者认为，当血清中HBsAg由阳性转阴时，并不代表乙肝病情完全缓解，此时依然能够从肝细胞内检测出HBV cccDNA。因此用HBV cccDNA作为检测指标用于病情的早期诊断以及病情再复发的诊断[8]。
1.2.3HBV cccDNA作为抗病毒药物疗效的监测指标
抗HBV治疗可使肝组织内HBV cccDNA含量显著下降，虽然想要达到完全清除HBV相当困难，尽管如此，其作用靶点是核外松弛环状DNA（rcDNA），随着时间延长，肝细胞核内cccDNA来源减少甚至可以消失，当病毒复制速度极慢，且其复制周期长于肝细胞的生命周期时，HBV cccDNA池可能被耗竭。对于慢性乙型肝炎患者，不论HBeAg阳性还是阴性都必须长期规范治疗，最大限度使用抗病毒药物治疗[9]。
1.3肝细胞中的HBV cccDNA
尽管如前所述，检测血清中HBV cccDNA和表面标志物可以在一定程度反映肝细胞中cccDNA，但是仍然不够准确。张永乐通过对30乙肝患者的血清进行检测，认为：①血清中HBV DNA阳性或者HBeAg阳性并不能断定肝细胞中的HBV正在复制；②血清中HBV DNA阴性或者HBeAg阴性也不能认为肝细胞中的不存在HBV的复制；③只有通过直接检测肝细胞中HBV cccDNA才能证实肝细胞内是否有HBV cccDNA的复制，肝细胞HBV cccDNA检测才是较为准确和可靠的标准。[10]
1.4HBV cccDNA的检测方法
1.4.1Southern blot法
经典的分子生物学方法，成本低，但是操作者需要有较高的操作技术水平，而且灵敏度也较低。
1.4.2 PCR方法
A原理：主要利用rcDNA 与 cccDNA理化特性和结构的两点差异来进行分离与检测：①rcDNA两条链上都有缺口，能被某些特定的酶降解，而cccDNA两条链都是完整的，不会被降解；②rcDNA能以共价结合方式与蛋白质形成复合物，而cccDNA不能[11]。
常用方法：①普通PCR；②竞争PCR；③荧光实时定量PCR；④套式与半套式PCR；⑤侵入检查（Invader Asssay）[12]
1.4.3基因测序
2.恩替卡韦在乙型肝炎患者抗病毒作用
2.1 作用机制
作为最新的抗乙肝病毒一线药物，恩替卡韦（Enticavir）是一种环戊酰鸟苷类似物，在被吸收进入体内后通过磷酸化变成具有活性的三磷酸盐。该三磷酸盐对于HBV DNA聚合酶天然底物三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷具有竞争抑制作用，从而抑制HBV DNA聚合酶的形成。体外研究已经证明恩替卡韦三磷酸盐是通过作用于HBV聚合酶的三种活性而发挥抗病毒作用的：①乙肝病毒DNA聚合酶的启动阶段；②以前基因组mRNA为模板逆转录形成负链的过程；③以合成的负链为模板合成正链的过程。恩替卡韦三磷酸盐在细胞内的半衰期为15h，对HBV DNA聚合酶的抑制常数Ki为0.0012μM。 2.2 药代动力学
I：吸收。该药品吸收迅速，健康人群口服后0.5到1.5小时即可达到峰浓度（Cmax）。按照每天给药一次，则6—10天后体内血药浓度可达稳态，累积量约为2倍。
此外要注意食物对口服吸收有一定影响影响。有研究表明，如果在口服0.5mg该药物的同时进食标准高脂餐、低脂餐，会导致药物在吸收时表现为轻微延迟（约0.25h-0.75h），在峰浓度方面表现为Cmax降低了约44—46%，药时曲线下面积（AUC）约降低18—20%。鉴于此，该药物推荐空腹服用（如餐前或餐后至少2小时）。
II：结合。体外研究表明，恩替卡韦与人的血浆蛋白结合率为13%。
III：分布。恩替卡韦的表观分布容积（Vd）大于全身液体量，说明该药物能广泛分布于各种组织。
IV：代谢和清除。在人和大鼠实验中，服用14C标记的恩替卡韦后，未检测到该药物的氧化代谢物或乙酰化代谢物，但观察到有少量Ⅱ期代谢产物如葡萄糖醛酸苷结合物以及硫酸结合物。
在达到血浆峰浓度后，恩替卡韦的血药浓度以双指数方式下降，需128—149小时达到终末清除半衰期。药物累积指数约为每天一次给药剂量的2倍，这表明其有效累积半衰期约为24小时。
该药主要以原形的形式通过肾脏清除，既可以通过肾小球滤过也可以通过网状小管分泌，同时清除率（C）为给药量62—73%。肾清除率大约为360—471mL/min，且不依赖于给药剂量。
2.3 恩替卡韦对乙型肝炎的疗效
恩替卡韦通过作用于HBV DNA三种活性，从而对HBV复制具有抑制作用，其抑制作用表现在两个阶段：①快速清除期：从血浆区室中快速清除外周循环血中的病毒颗粒；②缓慢清除期：通过抑制病毒复制使肝细胞中的病毒得到有效清除。由于缓慢清除期的存在，所以乙肝患者需要抗乙肝病毒药物的长期治疗。
2.4 恩替卡韦的耐药性
临床研究表明，一个氨基酸置换就足以导致病毒对拉米夫定和阿德福韦酯产生耐药。而恩替卡韦在治疗乙肝的优势就表现在其低耐药性上：即至少需要三个不同的氨基酸都被置换才有可能导致病毒对恩替卡韦产生耐药性。
在超过500名患者的II期临床试验的记录中，只有2名患者出现了针对恩替卡韦的耐药现象，值得注意的是，这两名患者都是以往HBV治疗无效的，在进入研究之前已经存在了HBV耐药株[13]。
2.5 恩替卡韦与其他药物的相互作用
恩替卡韦并不是细胞色素P450（CYP450）酶系统的诱导剂、抑制剂以及底物，因此恩替卡韦的药代动力学并不受诱导或抑制细胞色素P450酶系统代谢的药物的影响。
恩替卡韦与拉米夫定、阿德福韦同时服用并不会产生明显的药物相互作用。恩替卡韦以原形的形式通过肾脏清除，因此同时服用其他通过肾脏清除或能够影响肾功的药物可能会影响恩替卡韦的清除，但是其相互作用尚未有研究。
3.恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA的影响
恩替卡韦是最新的抗乙肝病毒一线药物，其作用机制是抑制HBV DNA聚合酶的三种活性，更重要的是其潜在的耐药性有限，需要至少三个氨基酸置换才能发生耐药突变，这使得许多已经对阿德福韦酯和拉米夫定产生耐药的慢性乙肝患者可以继续进行有效的治疗[14]。恩替卡韦通过抑制HBV DNA聚合酶的三种活性，使得HBV DNA含量逐渐减少，其中rcDNA渐渐耗竭，导致cccDNA池也逐渐耗竭，含量降低至极低水平。只有病毒复制被有效抑制，肝炎病情才能得到有效控制。
在宋淑静等的实验中，通过对112例慢性乙型肝炎患者使用恩替卡韦治疗两年，比较治疗前后患者体内HBV cccDNA含量，得出以下结果：治疗2年后在所有112例患者的血清中全部检测不到HBV cccDNA，而患者肝细胞内HBV cccDNA与治疗之前相比虽有降低但是仅降低了一个数量级。得出的结论是，使用恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎，可以有效抑制HBV的复制，但是不能清除肝组织中的HBV cccDNA，停药后仍有病毒反弹的可能，因此需要长期使用[15]。
恩替卡韦先是在快速清除期清除外周循环中的病毒颗粒，然后在缓慢清除期清除肝细胞中的病毒颗粒。如果仅仅因为观察到外周血中HBV cccDNA含量降低而马上减少药量或者停药，会导致病情的反弹甚至引起急性重型肝炎，后果非常严重。所以，通过检测肝细胞中的HBV cccDNA可反映恩替卡韋的疗效，对于恩替卡韦的使用疗程、用量及药物配伍等均有重要的临床指导意义[16]。
参考文献：
[1]陈智。乙型肝炎病毒cccDNA研究现状。中华传染病杂志，2003，21（1）：8-10.
[2]张涛，高英堂。乙肝病毒cccDNA的研究进展。国外医学病毒学分册，2005，12（6）：161-165.
[3]C.Seeger，W.S.Masson，Hepatitis B virus biology.Microbiomoler.Biol.Rev[J]，2000：51-58.
[4]覃亚勤，赵登蕴，刘彦慧。慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBV DNA、HBeAg关系研究[J]。中国实验诊断学，2009，13（9）：1193-1195.
[5]李华东，江建宁，陆晖，等。慢性乙型肝炎患者肝细胞HBV cccDNA、tDNA及HBV表面标志物的相关性研究[J/CD]。中华实验和临床感染病杂志，2012，6（4）：300-303.
[6]李红，唐红。乙肝病毒cccDNA检测方法及临床意义的研究进展[J]。生物医学工程学杂志，2009，26（3）：662-665.
[7]孙水林，陈明发，郑小君，等。慢性乙型肝炎患者检测血清cccDNA的临床意义[J]。Chinese Journal of Clinnical Medicine，2009，16（4）：524-534. [8]Chen Y，Sze J，He ML.HBV cccDNA in patientssera as an indicator for HBV reactivation and an carly signal of liver damage[J].World J Gastroenterol，2004，10（1）：82-85.
[9]Kock j，Baumert TF，Delaney Wet，et al.Inhibitiory effect of adfovir and lamivudine on the initiation of hepatitis B virus infection inprimary tupaia hepatocytes.Hepatitis B Virus biology.Microb.Molec.Biol Rev，2000，64：51-58.
[10]张永乐，徐岱，等，乙肝患者肝组织中HBVcccDNA与血清中HBV DNA、HBeAg的关系[J]。医学研究杂志，2008，37（3）：60-61
[11]He ML，Wu j，Chen Y，et al.A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCR.Biochem Biophys Res Commum，2002，295：1102-7
[12]Wong DK，Yuen MF，Yuan H，et al.Quantitation of HBV cccDNA in Chronic Hepatitis B patients.Hepatology，2004，40：727-737.
[13]Anastasia Rivkin.A review of entecavir in the treatment of chronic hepatitis B infection（LianYong Yang）.Current Medcial Research And Opinion：Anastasia Rivkin，2005，1845-1856.
[14]Chang TT，Gish RG，de Man R，et al.A comparison of entecavir and lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].N Engl J Med，2006，354（10）：1001-1010.
[15]宋淑静，徐飞，刘亚楠，等。恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者HBV cccDNA的影响。山东医药，2011年，51（29）：80-81
[16]李菲菲，任万华，主余華，等。肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量与拉米夫定、阿德福韦疗程的关系[J].中华传染病杂志，2009，27（11）：690-692.