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目的: 观察γ-羟基丁酸受体(gamma-hydroxybutyric acid receptor，GHBR)-抑制性G蛋白(inhibiting protein，Gi)信号通路在大鼠局灶性脑缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)损伤中的作用，进一步完善γ-羟基丁酸(gamma-hydroxybutyric acid，GHB)在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中脑保护作用的分子机制，为临床治疗缺血性腩损伤寻找新的靶标。
方法: 成年清洁级雄性SD大鼠，体重为260±20g，随机分为5组，分别为假手术组(sham)，缺血再灌注组(ischemia-reperfusion，I/R)，NCS-356(GHB受体选择性激动剂)160ug·kg-1(N160)、NCS-356 320 ug·kg-1(N320)、NCS-356640ug·kg-1(N640)剂量组，每组16只，各组均于缺血前30min和再灌注0h两次经侧脑室给药，给药体积均为10ul，sham组和I/R组给等体积的生理盐水。采用改良的Longa线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，大鼠再灌注24h后进行神经功能评分，评分为0分或5分者剔除，随机补充保证每组16只不变。实验分两部分：第一部分的40只大鼠处死后取新鲜缺血脑皮层组织约150mg(取视交叉前后约5mm的缺血脑皮层组织)置于-70℃冰箱，其中50mg用于放射免疫法测定大鼠大脑皮层细胞的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量，另外的100mg用于Western-blot法测定蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)四聚体的含量。第二部分的40只大鼠处死后用9 g·L-1生理盐水及中性40 g·L-1多聚甲醛灌流固定大鼠，取脑组织置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24h待包埋切片，用于观察缺血脑皮层病理形态学改变和免疫组织化学法测定缺血皮层细胞核中磷酸化cAMP反应蛋白结合元件(phosphorylation cAMP reactive protein binding element，P-CREB)的表达。
结果:
1.NCS-356对MCAO大鼠神经功能学评分的影响大鼠再灌注24h后采用单肓法对大鼠进行行为功能学评分，I/R组大鼠再灌注24h后出现明显神经功能障碍，行为学评分3.25±0.71，与Sham组相比P<0.01；N160、N320、N640剂量组均可降低行为学评分，分别为3.12±0.70，2.56±0.56，2.00±0.89，与I/R组相比，其中N640组可明显改善神经功能(P<0.05)，而N320和N160组则无统计学意义(P>0.05)。MCAO大鼠神经功能学评分随NCS-356剂量增加而降低。
2.NCS-356对MCAO大鼠缺血脑皮层病理形态学的影响光镜下检盘显示，Sham组大鼠脑皮层细胞排列整齐，细胞数量较多，形态完整，胞核大而明显，呈圆形或椭圆形，可见明显的核仁，神经元与周围组织之间无空隙；I/R组大鼠神经细胞皱缩，呈不规则形态，胞核固缩或消失，神经细胞与周围组织间有空隙；N160组大鼠光镜下观察与模型组差别不明显；N320组大鼠皮层细胞较I/R组形态完整，胞核大而明显，小部分胞体和胞核固缩；N640组大鼠脑皮层多数细胞形态、结构基本正常，胞核饱满呈圆形或椭圆形，核仁清晰。
3.NCS-356对MCAO大鼠缺血脑皮层细胞cAMP含量的影响I/R组大鼠缺血脑皮层cAMP含量(18.41±1.20 pmol·mg-1)明显高于Sham组(7.77±0.55 pmol·mg-1，P<0.01)，N160、N320、N640组分别为17.24±1.01pmol·mg-1，13.79±1.07pmol·mg-1，10.36±0.88pmol·mg-1。与I/R组比较，N320和N640组能降低MCAO大鼠缺血脑皮层细胞cAMP含量(P<0.01)，N160组对缺血皮层cAMP含量的影响无统计学意义(P>0.05)。MCAO大鼠缺血脑皮层cAMP的含量对NCS-356呈剂量依赖性(P<0.05)。
4.NCS-356对MCAO大鼠缺血脑皮层细胞浆内PKA四聚体含量的影响I/R组大鼠缺血皮层PKA四聚体含量(0.46±0.03)明显低于Sham组(1.00±00，P<0.01)，当给予NCS-356进行干预后，N160、N320、N640组MCAO大鼠缺血脑皮层PKA四聚体灰度分析相对值分别为0.49±0.02，0.62±0.05，0.77±0.04，与I/R组相比，N640组和N320组能升高MCAO大鼠缺血脑皮层细胞浆内PKA四聚体的含量(P<0.01)，N160组对PKA四聚体含量的影响无统计学意义(P>0.05)。MCAO大鼠缺血脑皮层PKA四聚体的含量对NCS-356呈剂量依赖性(P<0.05)。
5.NCS-356对MCAO大鼠缺血脑皮层细胞核内P-CREB表达的影响MCAO大鼠缺血脑皮层切片DAB染色显示，表达P-CREB的阳性细胞核呈棕褐色。与Sham组比较I/R组阳性细胞核深染而密集，而N640组和N320组与I/R组比较阳性细胞核明显稀少而且染色淡。由Leica Qwin分析系统得到的灰度值表明I/R组MCAO大鼠缺血脑皮层细胞核内p-CREB的表达(96.34±6.01)明显高于Sham组(28.12±1.47，P<0.01)，N160、N320、N640分别为89.79±6.40，52.77±4.63，37.84±2.67，N640组和N320组与I/R组比较能减少MCAO大鼠缺血脑皮层细胞核内P-CREB的表达(P<0.01)，而N160组与I/R组比较无统计学意义(P>0.05)。MCAO大鼠缺血腩皮层p-CREB的表达随NCS-356剂量增加而减少。
结论:
1.激动GHBR可改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的行为功能障碍，减轻MCAO大鼠脑病理性损伤，从而对缺血性脑损伤产生一定的保护作用。
2.激动GHBR能降低MCAO大鼠缺血脑皮层细胞内cAMP的含量、减弱PKA的活性并减少p-CREB的表达，由此提示激动GHB受体对大鼠局灶性脑缺血性再灌注损伤的保护作用可能与GHB受体-Gi-cAMP-PKA-p-CREB信号通路有关。