【目的】 本研究以国外最新研究为参考，结合国内研究状况，应用基因克隆、表达技术，研究深圳市人民医院新发现的β-内酰胺酶耐药基因CTX-M-38的耐药功能及其表达产物的各种理化及酶学特性。对新型β-内酰胺酶基因的研究，不仅为此类耐药细菌的检测、治疗及监控提供依据，也为新β-内酰胺酶抑制剂及新抗菌药物的研制和开发提供必要条件，同时丰富了细菌耐药基因知识库，也可为临床治疗这种细菌感染合理应用抗生素、预防和控制耐药菌株的出现和传播以及细菌的流行病学研究提供实验依据和指导。 【方法】 1．选取适合的受体菌，通过质粒接合试验研究耐药质粒的传递方式。 2．由临床产ESBLs耐药菌株中提取质粒，用PCR法扩增相关基因的DNA片段。 3．用PCR方法扩增接合子耐药基因片断，并测序，然后利用 DNAMAN 软件与CTX-M-38基因进行对比分析。 4．选用β-内酰胺酶基因高效表达的天然蛋白原核表达载体PET-26b(+)载体，用NdeI和XhoI内切酶双酶切。 5．用NdeI和XhoI内切酶双酶切临床耐药菌株的PCR扩增产物。 6．用DNA连接酶连接上述酶切产物，克隆转化感受态大肠杆菌DH<,5>和BL<,21>。 7．提取大肠杆菌DH<,5>。质粒，双酶切鉴定。 8．并用PCR法扩增其大肠杆菌DH<,5>。质粒，然后测序鉴定。 9．超声破壁法制备临床菌株、接合子和诱导表达克隆菌株的β-内酰胺酶粗提液，用PAGE电泳分析其等电点。 10．分别比较重组菌、临床菌株、接合子及其对照菌(只含空质粒载体)的耐药性差异，分析耐药基因赋予细菌的耐药特性。 【结果】 1．经过VITEK—Ⅱ全自动微生物分析系统的鉴定，接合子为大肠杆菌，与选取的受体菌相同，通过ESBLs初筛和确证试验，接合子为ESBLs阳性株。 2．对接合子和临床肺炎克雷伯菌所含CTX-M-38质粒进行PCR扩增，结果显示接合子和临床菌株含同一个耐药基因，基因片段长度为904bp。 3．对接合子PCR产物进行切胶回收，然后测序，结果显示与该课题组之前申报CTX-M-38的基因序列完全相同。 4．提取阳性克隆菌质粒，用XhoI和NdeI双酶切后产生941bp和5230bp的片断，分别与对照酶切后PCR产物和酶切后PET-26b(+)载体片断大小相同，证明重组质粒已成功转入，表明克隆成功。 5．PCR扩增阳性克隆菌质粒，并对扩增片断测序分析，结果显示与该课题组之前申报CTX-M-38 的基因序列完全相同，表明克隆过程中未发生基因突变。 6．对产CTX-M-38 临床分离菌株、接合子、重组BL<,21>菌(IPTG诱导)进行等电点测定，重组子PI为8.09，产CTX-M-38临床分离菌PI为8.04。考虑到临床株可能含有其他耐药基因编码的类时似蛋白影响，故以重组子等电点为CTX-M-38 的等电点即为8.09。 7．CTX-M-38 型临床分离株、接合子耐药性分析，纸片扩散法结果显示该菌株以及接合子对多种青霉素、窄谱头孢菌素及头孢曲松耐药，但对美洛培南、亚胺培南、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南敏感。 8．CTX-M-38 临床株、接合子、IPTG 诱导重组BL<,21>MIC 结果显示，产CTX-M-38的临床分离菌对头孢噻肟和氨苄西林/舒巴坦的耐药性较强，对其它药物的耐药性较弱。接合子除对环丙沙星、氨苄西林/舒巴坦敏感外，其耐药性同临床株基本相同。IPTG诱导的重组BL<,21>菌只对头孢噻肟敏感，它含有的PET-26b(+)是卡那霉素抗性的，所以对于胺卡那霉素耐药。 【结论】 1．本课题组在深圳人民医院首次发现一种新的 CTX-M 型β-内酰胺酶基因CTX-M-38，已经做了测序鉴定及世界权威专家的确认，GenBank 注册号为(AY822595)，已被收录于美国Lahey 临床医学中心的专业网站(http：//www.lahey.org/Studies)。 2．本课题以目前国内外引起医院感染的细菌耐药热点问题为基础，对含CTX-M-38基因产ESBLs肺炎克雷伯菌(为主要产ESBLs的细菌)的耐药机理进行深入、系统的研究，证明细菌耐药存在的自然转移能力强，转移后基因稳定表达，耐药性没有改变，可以引起广泛流行。 3．新基因CTX-M-38基因测序分析与bla<,CTX-M-14>(GenBank注册号AF252622)最相近，仅出现1个核苷酸及1个氨基酸的差异。与bla<,CTX-M-9>比较有两个氨基酸位点的差异，分别为Ser220→Arg和Ala231→Val。根据氨基酸序列分析，本研究发现的 CTX-M-38 属于 CTX-M-9 组。 4．CTX-M-38基因重组研究，在IPTG诱导下酶可稳定表达，利用PAGE电泳分析CTX-M-38 基因编码的β-内酰胺酶等电点为8.09。 5．药物敏感试验显示，IPTG诱导的重组BL<,21>菌只对头孢噻肟敏感，但不排除对青霉素和窄谱头孢菌素类的耐药。 6．新CTX-M-38 耐药基因有可能成为引起医院感染流行的危险因素，因合理选用抗生素进行抗感染治疗，严格控制CTX-M-38耐药基因产ESBLs细菌的传播流行。