香气是重要的果实品质指标之一,但我国主栽梨品种香味较淡,无法与西洋梨竞争。提高果实香气是当前我国梨产业面临的重要问题之一。针对这一产业问题,本研究以香气浓郁的南果梨果实为试材,在研究外源钙调控’南果梨’果实香气生理机制的基础上,采用RNA-seq表达谱分析技术和代谢组学技术,分析了 ’南果梨’果实成熟、后熟过程中及钙处理下差异表达的基因及差异代谢物和代谢途径,同时从’南果梨’中克隆了 PuADH1基因,并进了转化番茄功能验证,主要研究结果如下:1.研究了采前外源钙处理对’南果梨’果实香气组成和含量的影响,结果表明,钙处理’南果梨’果实中的总钙和水溶性钙含量显著增加,采前钙处理提高了 ’南果梨’果实可溶性固形物含量。钙处理’南果梨’果实和对照香气物质种类差异不显著,但钙处理显著提高了’南果梨’果实香气物质含量。采前钙处理使’南果梨’果实中的酯类物质,尤其是乙酯类物质的含量显著上升,乙醇、乙醛等物质的含量也显著上升,但钙处理抑制了果实乙烯的生成。钙处理提高’南果梨’果实香气物质含量主要是通过脂肪酸代谢途径实现的。2.以采前15天钙处理’南果梨’果实为材料,研究了钙处理提高’南果梨,果实香气的生理机制。采前钙处理使’南果梨’果实表皮蜡质层结构、果点结构、细胞排列发生了明显变化。成熟时,钙处理果实果皮蜡质层厚度和覆盖均匀度均低于对照;果实后熟5天时,钙处理果实蜡质层几乎完全脱落,对照果皮蜡质层仅部分脱落。钙处理’南果梨’果实果皮果点中心空隙较对照大,果点周围蜡质层脱落较对照多。钙处理’南果梨’果实表层细胞间隙较对照增大,细胞内含物较对照增多。采前喷钙处理后’南果梨’果实内钙的主要沉积部位包括细胞间隙、细胞壁、液泡、细胞质、导管等。与对照相比钙处理使’南果梨’果实表皮蜡质含量略有降低,但未达显著水平’南果梨’果实表皮蜡质化学组分主要包括烷烃、烯烃、链烷酸、醛类、萜类等,钙处理和对照果皮蜡质化学组分的种类没有差异。从’南果梨’果实中共分离鉴定出可溶性糖4种,有机酸6种、氨基酸15种,脂肪酸32种。钙处理显著提高了 ’南果梨,果实亚油酸和亚麻酸的含量,其中商熟期钙处理果实亚油酸含量较对照提高了 223%,亚麻酸含量较对照提高了 740%。采前钙处理显著提高了 ’南果梨’ 果实乙醇脱氢酶（ADH）、丙酮酸脱羧酶（PDC）和脂氧合酶（LOX）的活性,其中商熟期ADH的活性较对照提高了417.68%。因此认为,钙处理通过提高代谢底物（亚油酸、亚麻酸）的含量及ADH、PDC和LOX等酶的活性从而提高了 ’南果梨’果实香气。’南果梨’果实中共分离鉴定出7种键合态香气物质,钙处理显著降低了键合态香气物质的总含量,其中果皮中键合态香气物质的含量较对照减少了 26.74%,果肉中键合态香气物质的含量较对照减少了 11.11%。钙处理使β-葡萄糖苷酶活性显著高于对照,其中商熟期钙处理果实果皮β-葡萄糖苷酶活性为对照的146.25%,钙处理果实果肉β-葡萄糖苷酶活性为对照的124.44%。因此,钙处理通过提高β-葡萄糖苷酶的活性,促进了键合态香气释放,从而提高了 ’南果梨’果实香气。3.采用基于GC-MS和LC-MS的代谢组学技术,对成熟、后熟过程及钙处理、对照’南果梨’果实进行了代谢组学分析。成功建立了各分析组的PCA、PLS-DA、OPLS-DA多维统计分析模型,并结合统计分析,筛选出了各处理间的差异代谢物,对差异代谢物进行了 pathway分析。GC-MS共鉴定出111种化合物,差异较大的代谢物包括:甘氨酸、天冬酰胺、2-羟基戊酸、葡萄糖-1-磷酸、葡糖二酸、异麦芽酮糖醇等。对差异代谢物进行了 pathway分析,结果显示,戊糖和葡萄糖醛酸酯互换,黄酮类化合物合成,氰基氨基酸代谢等代谢通路存在差异。LC-MS共筛选得到141个差异代谢物,主要差异代谢物包括:氟伏沙明酸,黄嘌呤,9-择基-4-甲氧基补骨脂素9-葡萄糖苷,L-天门冬氨酸,双花母草素,异柠檬酸,L-天门冬酰胺,咖啡酸基苹果酸,半乳糖醇等。主要差异代谢通路包括:源于组氨酸和嘌呤的生物碱合成,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢,源于鸟氨酸、赖氨酸、烟酸的生物碱合成,咖啡因代谢,氮代谢,植物激素合成,氨酰基-转移核糖核酸合成,柠檬酸循环（三羧酸循环）,精氨酸和脯氨酸代谢,丁酸甲酯代谢,苯丙酯类合成等。4.利用表达谱测序技术对’南果梨’果实成熟、后熟过程的三个阶段及外源钙处理、未用钙处理的6个样本进行了表达谱测序分析。6个样本文库产生了16,661,134-18,800,372的原始数据,平均有69.81%的测序序列能定位到参考梨基因组上。在6个库中总共有10,776个基因差异表达,差异表达基因GO聚类分析和pathway显著性富集分析分为36个功能组和37条代谢通路。脂肪酸代谢通路基因FAD、ADH、PDC、LOX、lipase及一些转录因子存在差异表达,且与果实香气合成存在较高相关性。采用qRT-PCR方法证实了表达谱数据的可靠性。在此基础上我们还利用香气成分、代谢组与表达谱数据关联分析,筛选出了 ’南果梨’了香气合成、释放相关候选基因,为深入研究梨果实香气调控的分子机制提供了重要数据参考。5.ADH是梨果实香气物质形成的关键酶。本研究利用同源克隆技术,从’南果梨’果实中克隆到编码ADH的基因（Pbr027959.1,Aldehyde dehydrogenase family3 member 11）,命名为PuADH1。利用生物信息学方法,对其核苷酸及编码的氨基酸序列进行理化性质、结构域分析,并建立系统进化树。PuADH1具有完整的开放阅读框（ORF）,大小为1683bp,编码561个氨基酸,与苹果进化关系最近。构建了PuADH1基因与绿色荧光蛋白融合表达载体,利用农杆菌介导转化拟南芥原生质体,激光共聚焦扫描隧道显微镜观察表明PuADH1基因定位在细胞质中。构建植物表达载体pRI101-PuADH1并转化番茄进行功能验证,获得4个转基因株系。过表达PuADH1基因的番茄植株形态表型没有明显改变,但转基因番茄叶片和果实挥发性香气物质发生了显著改变,香气物质总量、醇类和醛类含量显著高于对照。