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Bt Cry1类毒素是由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在产孢过程中产生,并对鳞翅目昆虫幼虫有杀虫活性的一类毒素,主要包括Cry1Aa,Cry1Ab,Cry1Ac,Cry1B,Cry1C,Cry1E和Cry1F等。因为哺乳动物体内缺少毒素的受体,通常情况下认为Cry毒素对人类和家畜是无毒的,所以Bt基因被广泛的应用于转基因作物中,如玉米、大豆和土豆等。但随着转基因作物种植面积的逐年扩大,Bt基因抗虫植物开始作为人类食物及动物饲料应用,人们对它的环境生态安全性以及其对人类和其它哺乳动物的安全隐患的担忧逐渐增加。因此,对转Bt基因作物Cry毒素的表达量和食品中的残留量需要建立灵敏、可靠、方便的检测方法。本论文依托成熟的单克隆抗体制备、基因工程和噬菌体展示技术制备Bt Cry1类毒素的单克隆抗体和单链抗体,并对获得的抗体材料进行活性分析,建立Cry1类毒素的免疫学检测方法,将其应用于实际样品的检测当中。主要内容包括以下几个方面:1.抗Bt Cry1类毒素广谱单克隆抗体的制备及检测方法的建立通过比较七种 Cry1 类毒素（Cry1Aa,Cry1Ab,Cry1Ac,Cry1B,Cry1C,Cry1E,Cry1F）的三维结构,兼顾一级氨基酸序列和二级抗原性及亲水性分析,选择了三个多肽进行合成（T1,T2和T3）,将其与血蓝蛋白（KLH）偶联之后,免疫小鼠制备Cry1类毒素的广谱单克隆抗体。随后,建立了针对七种Cry1类毒素的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法。结果表明,三种半抗原多肽在制备Cry1类毒素抗体上具有不同的效果,其中由T2-KLH免疫制备的单克隆抗体2D3能够同时识别七种Cry1类毒素。2D3和七种Cry1类毒素的平衡解离常数（KD）分别为1.198×10-8 M、2.197×10-8 M、1.367×10-8 M、2.092×10-8 M、5.177×10-8 M、4.016×10-8 M 和3.497×10-8 M。建立的DAS-ELISA检测方法对七种Cry1类毒素的最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ）分别为15和30 ng/mL。本研究首次建立了能够同时检测七种Cry1类毒素的广谱特异性DAS-ELISA检测方法,它为建立多残留免疫检测技术提供了新的思路和技术路线。2.抗Bt Cry1类毒素重组单链抗体（scFv）的构建、表达及活性鉴定以杂交瘤细胞株2D3为RNA来源,反转录为cDNA之后,采用抗体的简并引物,通过PCR扩增出抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因序列,再通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）将VH和VL通过连接肽（Gly4Ser）3进行串联,成功构建了单链抗体（scFv）的基因序列。将scFv的基因序列构建到载体PET-26b中,再转入E.coli BL21中进行原核表达,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（WB）实验鉴定蛋白表达情况,用间接ELISA评价scFv的活性。结果表明,VH和VL基因序列扩增成功,在此基础上构建了完整的scFv基因序列,并在E.coli BL21中成功表达出了具有较高活性的scFv。随后,通过同源建模和分子对接分析,研究了 scFv与抗原的主要结合位置,并将VH和VL分别进行了表达,间接ELISA分别评价VH和VL的活性。结果表明,scFv与抗原的主要结合位置在VL部分,分别表达的VH和VL蛋白均具备特异性识别Cry1类毒素的能力,其中VL蛋白的活性更高,这也反向验证了分子对接的结果。随后,将两条轻链进行了串联,形成VL-VL的抗体结构,间接ELISA鉴定VL-VL抗体活性。结果表明,VL-VL的抗体活性相比于原scFv有了部分提高。3.Bt Cry1类毒素偏向鼠源单链抗体库的构建、筛选及检测方法的建立在本研究中,成功构建了针对Cry1类毒素的鼠源免疫偏向单链抗体库,绝对库容约为6.25×107 CFU/mL。经过四轮的亲和筛选,共获得七个识别Cry1类毒素的阳性克隆,随后对其进行了测序鉴定。在七个阳性克隆中,克隆scFv-3H9对六种Cry1类毒素表现出较高的结合能力。将其在E.coli HB2151中进行了表达,SDS-PAGE结果表明,成功表达了可溶性的scFv-3H9抗体,大小约为27 kDa。将抗体纯化之后用于构建检测六种Cry1类毒素的DAS-ELISA方法,建立的方法对六种Cry1类毒素的LOD和LOQ分别为3.14-11.07 ng/mL和8.22-39.44 ng/mL,线性相关系数大于0.997。添加回收实验结果表明,Cry1类毒素在水稻叶片样品中的平均添加回收率为84.2%-94.8%,变异系数（CV）小于8.2%,表明建立的检测方法具有较好的准确性,可用于农产品样品中Cry1类毒素的定量检测。4.Bt Cry1Ab毒素特异性单克隆抗体的制备及检测方法的建立在本研究中,基于同源建模分析,选择了一个新颖的半抗原多肽进行合成,并将其与KLH偶联之后作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体。最终获得一株能够识别Cry1 Ab毒素但不识别Cry1 Ac毒素的细胞株2C12,它与Cry1 Ab毒素的KD值为1.947×10-8 M。基于此单克隆抗体,建立了检测Cry1Ab毒素的特异性DAS-ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法。在DAS-ELISA测定中,对Cry1Ab毒素的LOD和 LOQ 分别为 0.47±0.11 和 2.43±0.19 ng/mL,定量检测范围为 2.5-100 ng/mL。在定量范围内,Cry1Ab毒素在水稻叶片和米粉中的添加回收率为75.3%-115.2%,CV小于8.6%,表明建立的DAS-ELISA检测方法能够较准确的测定农产品样品中的Cry1Ab毒素。建立的胶体金试纸条的最低肉眼检测限（vLOD）为0.1 μg/mL,这与商品化的Cry1Ab/Cry1Ac毒素胶体金试纸条的检测限在同一水平。在实际检测中,胶体金试纸条的检测结果与DAS-ELISA的测定结果一致,表明胶体金试纸条具有较好的准确性。在0.1、0.2和0.5-1 μg/mLCry1Ab毒素添加水平下,20次重复测定的假阳性或假阴性率分别为10%、5%及0%,证明胶体金试纸条具有较好的重复性。另外,储存3个月的胶体金试纸条在测定0.1 μg/mL Cry1Ab毒素时的检测线（T）和控制线（C）仍然清晰可见,表明胶体金试纸条的稳定性较好。据我们所知,这是首次报道的能够特异性检测Cry1Ab毒素而不受Cry1Ac毒素影响的DAS-ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法。本研究为高特异性抗体的制备提供了新的思路。