铜绿假单胞杆菌一直以来是困扰野生动物养殖的一大难题,属较难防控的细菌性疾病之一。该菌具有较强的耐药性,感染机体后,可产生多种毒力因子,其具有很强的致病作用,单独使用抗生素的治疗效果并不理想,这限制了抗生素的广泛使用。因此,合理的疫苗接种对该疫病的预防起着至关重要的作用。目前,我国还没有针对铜绿假单胞菌病的有批文的疫苗。本研究根据林麝养殖场铜绿假单胞菌的分布情况,通过动物攻毒试验,成功筛选出了一株毒力最强的菌株作为试验菌株。经提取和纯化该菌株的外膜蛋白,并进行免疫接种,从细胞免疫、体液免疫和攻毒保护三个方面来评估该菌株的免疫原性,并对免疫效果进行评价,以期为林麝铜绿假单胞菌病的防控提供参考依据。本文所开展的研究和取得的结果如下：1.试验菌株的筛选试验选取本实验室从林麝体内分离并保存的7株铜绿假单胞菌,并均用同一菌液浓度对试验小鼠进行攻毒,从中筛选出一株毒力最强的菌株(sp-19株),最终,测得其对小鼠的LDso是6.7114×106 CFU。2.外膜蛋白的纯化及鉴定通过试剂盒提取sp-19株的外膜蛋白。经SDS-PAGE电泳分析,显示该方法提取的外膜蛋白有8个蛋白条带,其分子量分别约为104 KD、71 KD、52 KD、43 KD、36KD、 22KD、18 KD和9 KD。免疫印迹结果显示,这些外膜蛋白均能与抗铜绿假单胞菌sp-19株阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。3.外膜蛋白免疫效果评价分别将试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白、sp-19株全菌制备的免疫原和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫实验小鼠。在四免后,采用间接ELISA的方法检测试验小鼠的抗体动态变化,结果显示,各抗原免疫组小鼠体内抗体滴度随免疫进程持续升高。其中,试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白抗原组小鼠的抗体水平最高,sp-19株全菌制备的免疫原组和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白抗原组次之,其效价分别达到1：12500、1：2500和1：500。体外淋巴细胞增殖试验表明,sp-19株外膜蛋白能显著促进各抗原免疫组的小鼠T、B淋巴细胞的增殖,其增殖率分别为3.05、2.51和1.33：采用细胞因子检测试剂盒对免疫0、15、29、43和50天各抗原免疫组小鼠血液中的IL-4和IFN-y进行检测,其含量最高达104pg/ml、87 pg/ml.66 pg/ml和134pg/ml、131 pg/ml和97 pg/ml。4.外膜蛋白免疫保护性研究分别用试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白、sp-19株全菌制备的免疫原和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫小鼠,二免后用5倍LDso的sp-19株活菌经腹腔攻毒,结果显示,试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白保护率为87.5%,sp-19株全菌制备的免疫原保护率为62.5%,超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白保护率仅为12.5%,生理盐水对照组和佐剂对照全部死亡。被动免疫试验中,先分别将各抗原组免疫56天后的高免血清0.2 ml腹腔注射于小鼠体内,2h后用2倍LDso的铜绿假单胞菌sp-19株活菌经腹腔攻毒。结果显示,试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白保护率为100%,全菌制备的免疫原保护率为87.5%,超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白为仅25%,生理盐水对照组全部死亡。