奶牛乳房炎是奶牛的一种多发病,特别是隐性乳房炎,它造成的经济损失非常巨大。尽管各国兽医工作者多年来对该病的预防与治疗研究付出了极大的努力,但仍无满意的结果,至今仍以抗生素治疗为主。由于抗生素残留和耐药菌株的出现造成奶品质下降和治疗困难,所以迫切需要进行新的预防与治疗方法的研究和应用。各国研究证实乳房炎重在预防。而目前只有大肠杆菌的研究取得成功。J5 菌苗对于 G-杆菌引起的乳房炎保护率在 85%以上。但有关 G+菌苗少见报道,而在我国,奶牛隐性乳房炎的主要病原菌即是 G+菌,因此,对于 G+菌苗的研究具有重要的应用价值。本研究在总结国内外研究的基础上,结合乳腺生理研究进展,进一步通过分离病原菌,调查西安、杨凌等地奶牛乳房炎的主要病原菌;探讨不同病原菌对乳腺局部免疫的影响,研制一种疫苗用于预防和治疗乳腺炎。主要内容包: 1 体细胞计数方法的改进 由于乳汁中体细胞的变化与炎性反应密切相关,体细胞计数(SCC)被好多国家认为是监控乳汁质量的标准方法。但由于乳汁中脂肪的影响,使得 SCC 常用方法不好操作,尤其无法对初乳和泌乳期末乳汁中体细胞进行计数。我们经过长期摸索,总结了一套较好的方法,并且用本方法在实验中发现了一些新的现象。 2 病原菌的分离调查 从 2002 年 10 月起,应用LMT 及体细胞计数(SCC)方法,从西安及其周边地区 1000头奶牛中抽取了 48 头共 184 个乳区,进行了奶牛隐性乳腺炎的调查及病原菌的分离鉴定。结果西安及其周边地区患隐性乳腺炎奶牛占总头数的 66.7%,患隐性乳腺炎乳区占总乳区的 35.4%。4 个乳区全阳性者占 15.2%。共分出菌 67 株,其中葡萄球菌 41 株。链球菌 20 株,二者共 61 株,占总检出菌 91%。值得注意的是表皮葡萄球菌及肺炎链球菌占总检出菌的比例较大,分别占到 16.7%和 8.3%。而未分离到大肠杆菌。由葡萄球菌造成患隐性乳房炎的牛总牛数 45.8%。链球菌造成患隐性乳房炎的牛总牛数 33.3%,二者共占 79.1%。其中分得一株非常典型的金黄色葡萄球菌,鲜血琼脂平板培养 24h 后出现明显的溶血环,宽度达 8mm 左右,呈双环。里圈为约 4mm 的完全溶血环,外圈为约 3mm的不完全溶血环,4℃冰箱过夜后出现第三圈完全溶血环,宽约 1.5~2 mm 左右。 同时分出三株 G+芽孢杆菌,经鉴定初步认为其为苏云金芽孢杆菌,苏云金芽孢杆菌引起奶牛乳腺炎在国内外鲜见报道,该菌培养特性及染色镜检又与蜡样芽孢杆菌极为相似。经动物试验证明该菌经腹腔注入小鼠,其毒素可致死小鼠,同时证明该菌具有很强毒素<WP=6>产生能力。 3 疫苗制造及疫苗评价 3.1 奶牛乳腺炎分离细菌裂解苗家兔免疫试验 应用自奶牛乳房炎检测为阳性的牛乳汁分离的 4 种优势 G+菌,分别与 3 种佐剂制成细菌裂解苗免疫家兔,于免疫后第 7 天开始,间隔 7 天采集心脏血,分离血清,以试管凝集试验检测血清中抗体效价,以此评价所分离细菌的免疫原性和所用佐剂的免疫促进作用,筛选适宜的佐剂。结果显示,所分离的优势 G+菌刺激家兔机体后可产生高效价的抗体,免疫后第 7 天,抗体效价开始明显上升,第 28 天左右达到峰值,一直持续到试验结束(63 天)。比较 3 种佐剂的免疫促进效果,以佐剂 C 最好。三种疫苗间差异不显著,与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。 3.2 奶牛乳腺炎分离细菌裂解苗奶山羊免疫试验 应用自奶牛乳房炎检测为阳性的牛乳汁分离的 4 种优势 G+菌,分别与 3 种佐剂制成细菌裂解苗免疫奶山羊,于免疫后第 7 天开始,间隔 7 天采集静脉血,分离血清,同时收集乳汁并分离乳清,以试管凝集试验检测血清中及乳清中抗体消长规律,以此评价所分离细菌的免疫原性和所用佐剂的免疫促进作用,筛选适宜的佐剂,并探讨乳腺局部的免疫状况。结果显示,所分离的优势 G+菌刺激奶山羊机体后可产生高效价的抗体,通过相关性分析血清中及乳清中抗体的效价显著相关。, 3.3 乳房炎多联疫苗免疫后初乳中吞噬细胞活性的观察 应用自奶牛乳房炎检测为阳性的牛乳汁分离的 4 种优势 G+菌,配合佐剂制成细菌灭活多联苗,免疫分娩前 30 天的奶山羊,于奶山羊分娩后收集初乳并分离乳中的巨噬细胞和嗜中性粒细胞。通过巨噬细胞和嗜中性粒细胞的体外吞噬试验,探讨乳腺局部的免疫状况。结果显示,初乳中巨噬细胞的吞噬百分率可达 58%;嗜中性粒细胞的吞噬百分率可达 53%,吞噬指数可达 1.25,明显高出未免疫奶山羊的相应指标。证实了:(1)所制备的多联苗能促进围产期乳腺局部的细胞免疫功能,(2)所制备的多联苗副作用小,不会引起流产。