论文部分内容阅读
结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,每年有很多人死于结肠癌。结肠癌多发于男性和老年人群中。大部分结肠癌的病发与不良的生活及饮食习惯有关,如饮食不规律,高脂肪低纤维食物的摄入,吸烟,酗酒等。还有一部分与遗传相关。在美国,结肠癌近五年的存活率为64.9%,相比过去十年已有所提高。目前结肠癌的治疗手段以手术疗法为主,随着科研水平的不断提高,医疗技术的不断改善及相关治疗药物的研发,结肠癌治愈的成功率大大提高。然而,由于结肠癌前期症状易与其他胃肠类疾病混淆从而被人忽略且预后性差,拥有极高的复发率,故目前仍然缺乏针对它的有效治疗措施。因此进一步探索结肠癌发病的分子机制,寻找新的治疗靶点或者设计新的治疗药物对于治疗结肠癌刻不容缓。课题组先前的研究成果表明DHX33是一类高度保守的DEAD/DEAH RNA解旋酶.在哺乳动物体内参与诸多生物学进程,例如核糖体的合成,RNA的转录及剪切,蛋白质的翻译等。课题组之前的研究成果中表明DHX33是细胞增殖和生长的重要调节因子,并且它在多种人类癌症中存在高效表达的现象,例如人类非小细胞肺癌,乳腺癌等。然而,它是否同样参与结肠癌的发生、发展以及它在结肠癌中的潜在功能及作用的分子机制目前还尚不清楚。为解答此中的疑问,探索DHX33在人类结肠癌发生发展中潜在的功能,本研究首先采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)利用DHX33抗原抗体结合的高度特异性检测在结肠癌组织,淋巴转移组织,邻近正常组织及正常组织内DHX33的表达量是否存在显著性差异。然后利用Western blot和实时定量聚合酶链反应(RT PCR)检测在正常结肠细胞系FHC,结肠癌细胞系HCT116和LOVO细胞系内DHX33表达的差异性。从而发现在在结肠癌组织、淋巴转移组织及结肠癌细胞系内DHX33均存在过量表达的现象。随后课题采用两种不同的编码shRNA的重组慢病毒颗粒转染人结肠癌细胞HCT116和LOVO从而沉默DHX33的表达,并且以shScramble作为阴性对照。然后用Western blot和实时定量聚合酶链反应(RT PCR)分别检测细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移相关基因在mRNA和蛋白质表达水平发生的变化,进一步探索DHX33在结肠癌细胞内的作用机制。研究结果表明DHX33的敲低会减少下游CdCs,McMs,MMPs,E2F1,Bcl-2基因的转录及蛋白质的表达,同时增加促凋亡基因Bad的转录和蛋白表达。另外,通过细胞增殖、细胞独立锚定、细胞群形成及细胞凋亡等实验进一步验证在结肠癌细胞系内DHX33的敲低对癌细胞恶性表型的影响,从而阐明DHX33在结直肠癌发生发展中的具体作用。本课题的研究结果表明:DHX33在结肠癌组织和结肠癌细胞系内均过量表达,且DHX33的敲低可显著抑制结肠癌细胞的增殖和生长,使结肠癌细胞丧失诸多的恶性表型并促进结肠癌细胞的凋亡,免疫缺陷小鼠的异体成瘤实验进一步表明DHX33敲低可以抑制结肠癌细胞在体内的肿瘤形成和生长。Wnt/β-catenin信号通路是生物体内一条高度保守的信号通路,参与诸多生物学进程,譬如胚胎发育,细胞增殖和分化,细胞代谢等。由于Wnt/β-catenin信号通路的多功能性,所以Wnt/β-catenin信号通路已成为近几年生物学研究的一大热点。近年来,诸多研究表明:在结肠癌中Wnt/β-catenin信号通路调节是异常的。所以本课题大胆提出猜测:在结肠癌内DHX33的过量表达是否也与Wnt/β-catenin信号通路存在某些不为人知的关联。Wnt3a作为经典的Wnt信号激活剂可以通过与细胞膜表明的受体相结合激活Wnt/β-catenin信号通路;DKK1作为经典的Wnt信号抑制剂可以通过与细胞膜表明的Wnt受体竞争性结合从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。所以为进一步探讨DHX33在结肠癌中的作用是否与Wnt/β-catenin信号通路的调节有关,本课题首先采用Western blot和实时定量聚合酶链反应(RT PCR)分别检测了在结肠癌细胞系HCT116和LOVO内Beta-Catenin是否也存在过量表达的现象。结果表明在结肠癌细胞系内Beta-Catenin亦存在过量表达的现象。然后采用两种不同的编码shRNA的重组慢病毒颗粒转染人结肠癌细胞HCT116从而沉默DHX33的表达,并且以shScramble作为阴性对照。72小时后收集细胞采用Western blot检测了在结肠癌细胞系HCT116内β-catenin环链蛋白、DHX33和磷酸化GSK3β表达量的变化,结果表明DHX33的敲低可显著降低细胞内Beta-Catenin的水平。Wnt3a作为经典的Wnt信号激活剂可以通过与细胞膜表明的受体相结合激活Wnt/β-catenin信号通路;DKK1作为经典的Wnt信号抑制剂可以通过与细胞膜表面的Wnt受体竞争性结合从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。为进一步验证实验结果,本课题分别使用Wnt/β-catenin信号通路激活剂和抑制剂:重组人类Wnt3a蛋白及重组人类DKK1,在一定浓度下(重组人类Wnt3a:150ng/ml;重组人类DKK1:200ng/ml)处理HCT116细胞72 h,然后收获细胞,采用Western blot和实时定量聚合酶链反应(RT PCR)检测分别用Wnt3a、Dkk1处理组及阴性对照组内DHX33,Beta-Catenin及pGSK3-Beta表达量在蛋白水平及mRNA水平的变化。实验结果表明利用Wnt3a处理HCT116细胞后会积累Beta-Catenin并且增加DHX33的表达,相反,利用Dkk1处理HCT116细胞后会减少Beta-Catenin并且下调DHX33的表达。另外,为进一步验证两者间的关系,本课题进行了Beta-Catenin的Rescue实验:首先利用sh-DHX33敲低DHX33并以shSCR组作为阴性对照,72h后添加150ng/ml的Wnt3a处理48h然后利用Western blot和实时定量聚合酶链反应(RT PCR)检测在shSCR组,shSCR加Wnt3a组,sh-DHX33组及sh-DHX33加Wnt3a组四组细胞样品内β-catenin环链蛋白、DHX33和磷酸化GSK3β表达量的变化,并对四组细胞进行为期6天的生长曲线绘制。结果表明DHX33对Beta-Catenin的调节作用在结肠癌细胞内至关重要,DHX33存在时,Wnt3a可显著激活Beta-Catenin,从而上调DHX33,促进细胞增殖;而敲低DHX33对结肠癌细胞增殖引起的抑制作用利用Wnt3a激活Beta-Catenin几乎无法回复。氯化锂作为经典Wnt信号通路的激活剂,在正常细胞及组织内主要通过直接抑制GSK3-Beta的活性解体GSK3-Beta与APC及Axin组成的Beta-Catenin降解三元复合物从而引起Beta-Catenin的积累激活Wnt/β-catenin信号通路。有研究表明在癌组织及癌细胞内,氯化锂具有激活或抑制Wnt/β-catenin信号通路的双重作用。同时,有研究表明氯化锂引起的GSK3-Beta活性的抑制在部分癌症中也可能引起严重的细胞凋亡。本课题研究中,同样也使用氯化锂干扰GSK-3?活性介导的Beta-Catenin水平的变化来分析Wnt/β-catenin信号通路对DHX33的调控作用。首先,采用低浓度氯化锂(1mM)处理HCT116细胞24h,然后采用Western blot和RT PCR分别检测β-catenin环链蛋白、DHX33和磷酸化GSK3β表达水平的变化。结果表明低浓度的氯化锂通过过表达GSK3-Beta从而减少Beta-Catenin的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路,但此时DHX33却明显上调,与前面叙述的实验结果相矛盾,所以本课题猜测,是否GSK3-Beta同样参与DHX33的调节。于是本课题采用高浓度的氯化锂(10mM,20mM)分别处理处理HCT116细胞4h,48h,72h.然后采用Western blot和RT PCR分别检测β-catenin环链蛋白、DHX33和磷酸化GSK3β表达水平的变化。结果表明高浓度的氯化锂在短时间内抑制Beta-Catenin的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路,上调DHX33,随着时间的延长,通过抑制GSK3-Beta的激活从而积累大量Beta-Catenin,激活Wnt/β-catenin信号通路引起下游部分细胞周期,迁移相关基因的上调,但此时DHX33的表达却明显被抑制,且促凋亡相关基因过表达抑凋亡基因明显下调。引起严重的细胞凋亡。一系列研究结果表明:Wnt信号通路参与结肠癌细胞内DHX33表达的调控,同时DHX33也可通过调节Wnt/β-catenin信号通路在结肠癌的发生发展中发挥作用,二者具有相互调控的关系。且在结肠癌细胞系内,GSK3-Beta可能对DHX33的表达也具有调节作用,而且这种调节作用与Beta-Catenin同时存在时,可能占据主导地位。在本课题研究中,依然有很多待解决的问题存在,为进一步探究DHX33,Beta-Catenin及GSK3-Beta间准确的调控关系,接下来会采用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP),凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀技术(CHIP)分析它们是否直接结合并识别其可能存在的结合位点,然后将DHX33启动子克隆到荧光素酶报告分子(luciferase reporter)结构中去分析它们之间的转录调控关系。本课题首次创造性的提出对DHX33在结肠癌发生发展过程中功能及作用机制进行探索性研究。揭示了DHX33在人类结肠癌发生发展过程中的潜在功能及其分子机制。并且首次揭示了DHX33与Wnt/β-catenin信号通路及主要成分GSK3β在人类结肠癌发生发展过程中可能存在的复杂的相互调控关系。这一发现能够为结肠癌的治疗提供新的治疗靶点或者为结肠癌治疗的药物设计提供新的思路,给广大结肠癌患者的治疗带来新的福音。