【摘 要】
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根据禽流感病毒鹅分离株0R株已发表的核苷酸序列,设计并合成了一对引物NPP1/NPP2,扩增NP基因完整的开放阅读框架(ORF),扩增长度为1494bp;根据该基因的酶切图谱和表达质粒多克
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根据禽流感病毒鹅分离株0R株已发表的核苷酸序列,设计并合成了一对引物NPP1/NPP2,扩增NP基因完整的开放阅读框架(ORF),扩增长度为1494bp;根据该基因的酶切图谱和表达质粒多克隆位点的分析,在上游引物NPP1中加入了限制性内切酶EcoRI,在下游引物NPP2中加入了限制性内切酶Xba I;为得到表达的融合蛋白,设计下游引物时,切除了NP基因的终止密码子,并注意调整NP基因和其后融合的载体序列的阅读框架的正确.用10日龄SPF鸡胚复壮病毒,病毒接种后,所有鸡胚在48h内死亡,死亡胚的全身均有不同程度的出血.用病毒尿囊液进行HA试验,凝集价平均在2<9>.分别用H5、H7、H9亚型AIV抗血清和ND抗血清进行HI试验,发现该病毒仅能被H5亚型抗血清所抑制.从收获的含毒尿囊液中抽提病毒的总RNA.利用RT-PCR方法成功扩增出NP基因.通过酶切、连接构建重组表达质粒,在含25 μ L/mLZeoci的LB固体培养基上筛选阳性克隆.将经质粒PCR鉴定和双酶切鉴定为阳性的转化子送测序做进一步鉴定.测序结果表明:NP基因正确插入载体pPICZB的适当位置中,插入基因长度为1494bp,胞内表达的融合蛋白阅读框架全长为1564bp,可编码521个氨基酸残基(498+23),与预期完全一致.从理论上计算,表达产物的预期分子量为62.5KD.将插入基因(NP-gene)与已发表的相应序列(AF370122)和GeneBank上序列号为AF216728和AF144303的H5N1亚型AIV NP基因进行同源性比较.NP-pPICZB经BstXI单酶切线性化;回收纯化后电击转化毕赤酵母工程菌X-33,转化菌液涂布YPDS+Zeocin选择性培养基获得上百个单菌落.通过提高抗生素浓度从20株单菌落中筛选出4株具高抗性的转化子进行少量诱导培养,分别经过BMGY培养基激活培养,BMMY培养基诱导表达.1.0%甲醇诱导表达3d后,取菌体裂解液进行SDS-PAGE分析,有一株菌的菌体裂解液可见一条相对分子量约64KD清晰蛋白条带.将此菌株进行扩大诱导表达,在重组酵母诱导的0、1、2、3、4、5d各取样一次,以观察不同诱导时间目的蛋白的表达情况,结果显示在诱导24h可见目的蛋白表达.该研究表达的NP蛋白在作为免疫诊断试剂和基因工程疫苗的制备等方面具有潜在的应用价值.
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