微小RNA（microRNA,miRNA）是一种小片段非编码RNA（长度约22nt）,可通过诱导动物和植物中的基因沉默或降解发挥作用。一系列研究发现,miRNA可参与各类生理发育调控过程,其中包括细胞生长和凋亡、造血、病毒防御、肿瘤发生和脂肪代谢等。同样,在骨骼肌成肌调控过程中,大量的miRNA也被证实可起到重要作用。由于肌肉发育的生物学过程复杂多样,与成肌调控相关的基因又往往受到多个miRNA的共同作用,许多可能参与骨骼肌发育调控的miRNA功能还有待深入研究。已有研究表明miR-696可在骨骼肌脂肪酸氧化和线粒体生物发生中发挥重要作用,但其在骨骼肌发育中的具体作用及机制尚不清楚。此外,miR-22在猪不同生长阶段或不同品种猪背最长肌相关测序研究中发现存在较高倍数的差异表达,而其影响成肌细胞增殖或分化的机制未见报道。为此,本研究重点选择这2个miRNA作为进一步研究对象,研究miR-696和miR-22在不同组织及骨骼肌中的表达模式,利用小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化模型,探究两者在骨骼肌成肌细胞增殖分化过程中的具体作用机制,进一步解析miR-696和miR-22参与成肌调控所靶向的重要基因或信号通路。此外,本研究发现miR-22在成肌细胞增殖与分化中具重要作用,且在不同肌纤维类型（红肌和白肌）肌肉中存在差异表达,同时肌纤维类型又是影响猪肉色好坏的重要因素,为此进一步分析苏淮猪miR-22所在基因序列上的多态位点并开展与苏淮猪肉色性状的关联性分析,以期鉴别miR-22在基因组水平可影响苏淮猪肉色性状变异的分子标记。主要结果如下:1.miR-696在小鼠不同组织及不同类型肌肉中的表达模式分析实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR,RT-PCR）结果表明,miR-696在脂肪中表达最高,在骨骼肌、肾脏和肝脏中具有较高表达,其后表达量由高到低依次为胃、心脏、肺和脾。此外,miR-696在比目鱼肌（SOL,红肌）中的表达显著低于趾长伸肌（EDL,白肌）。2.miR-696在骨骼肌细胞增殖与分化中的调控机制研究RT-PCR结果表明,miR-696表达水平在C2C12细胞增殖期间和分化第2天至第6天间呈下降趋势。过表达miR-696可使EdU 阳性细胞的比例减少,并在G0/G1期显著阻滞细胞,使处于S和G2期的细胞比例减少,且伴随增殖指数的显著降低。同时,miR-696还可抑制细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E和Cdk4的表达。在成肌分化过程中,过表达miR-696可显著抑制分化标志基因MyHC和MyoG的表达,使肌管形成数目减少。而抑制miR-696的表达后,结果与之相反,可促进成肌细胞增殖与分化。在C2C12体外细胞模型中,miR-696和CNTFRα的表达趋势相反。miR-696可特异性靶向结合CNTFRα并抑制其表达。敲减CNTFRα的表达可抑制C2C12细胞的增殖与分化。因此,miR-696通过靶向CNTFRα抑制C2C12细胞增殖和分化。3.miR-22在猪与小鼠不同组织及不同类型肌肉中的表达模式分析RT-PCR结果表明,miR-22在猪背最长肌和脂肪中表达最高,比目鱼肌中次之,其后表达量由高到低依次为心脏、肝脏、胃、肾脏、脾和肺。此外,与比目鱼肌、腰大肌、咬肌等氧化型纤维比例较高的红肌肌肉相比,酵解型纤维比例较高的白肌肌肉背最长肌和股二头肌中,miR-22的表达量更高。在小鼠中,miR-22在骨骼肌和脂肪中的表达最高,其后表达量由高到低依次为肺、心脏、脾脏、胃、肾脏和肝脏。在比目鱼肌（SOL,红肌）中,miR-22的表达水平显著低于趾长伸肌（EDL,白肌）。4.miR-22在骨骼肌细胞增殖与分化中的调控机制研究在C2C12细胞增殖阶段的不同时间点,miR-22的表达无显著差异。而在细胞分化阶段,miR-22的表达从第2天到第6天逐渐上升。过表达miR-22后,EdU 阳性细胞比例显著减少,并可在GO/G1期阻滞细胞,同时伴随增殖指数的显著减少。过表达miR-22还可显著抑制细胞周期相关基因Cyclin D1和Cdk4的表达。相反,抑制miR-22表达后,EdU 阳性细胞以及S期细胞的比例明显增加,细胞周期相关基因的表达也显著上升。在细胞分化阶段,过表达miR-22可显著促进MyHC和MyoG的表达,增加肌管数目,而抑制miR-22的表达后,结果相反。通过靶基因预测和双荧光报告基因检测后发现,TGFBR1是miR-22直接调控的靶基因。在细胞增殖与分化过程中,过表达miR-22可抑制TGFBR1及其下游smad3信号通路的表达,而当内源性miR-22被抑制时,TGFBR1及其下游smad3信号通路表达水平则显著升高。此外,通过转染TGFBR1 siRNA或TGFBR1 pcDNA 3.1,抑制或促进其表达后发现,TGFBR1可促进成肌细胞增殖并抑制分化,这与miR-22的作用结果相同。用不同浓度的TGF-β1（0、10、20 ng/ml）处理C2C12细胞,可显著抑制miR-22 的表达。在 TGF-β1 处理后的 C2C12 细胞中,miR-22 能够抑制 TGFBR1 蛋白的表达。综上所述,miR-22可通过抑制TGFBR1表达参与抑制成肌细胞增殖并促进其分化。同时,TGF-β1在C2C12细胞中又可抑制miR-22的表达。5.ssc-miR-22基因上SNP与苏淮猪肉色的关联性分析在300头苏淮猪中随机选择8个个体,利用特异性引物扩增包含ssc-miR-22前体序列在内的688 bp长度片段。测序后,发现存在多个突变位点,选择其中最接近miR-22前体序列的一个G/A突变位点,对300头苏淮猪个体进行多态性分析。通过与苏淮猪屠宰后2小时及24小时的肉色亮度值（L值）、红度值（a值）、黄度值（b值）进行关联分析,发现G/A突变位点与苏淮猪屠宰后2小时的肉色a值间存在极显著相关（P=0.0008）。定量分析结果表明,该位点突变可对骨骼肌中miR-22的表达产生影响,其中miR-22的表达量在AA型个体中最低,且显著低于GG型,极显著低于GA型;GG基因型和GA基因型个体间无显著性差异。综上所述,本文得出如下结论:1.miR-696在不同组织中均有表达,且在脂肪和骨骼肌中高表达,并在不同肌纤维类型（红肌与白肌）中差异表达。2.miR-696可靶向调控CNTFRα的表达,从而抑制成肌细胞增殖与分化。3.miR-22在不同组织中均有表达,且在骨骼肌和脂肪中高表达,并在不同肌纤维类型（红肌与白肌）中差异表达。4.miR-22可靶向调控TGFBR1的表达,从而抑制成肌细胞增殖并促进分化。而TGF-β1又可抑制miR-22的表达,参与形成重要的负反馈调节网络。5.ssc-miR-22基因上的G/A突变位点与苏淮猪肉色显著关联,可作为苏淮猪肉色选育的一个分子标记。同时,miR-22可能在肌肉颜色的调控中具有重要作用。