论文部分内容阅读
苯甲酸、山梨酸、糖精钠是常用的食品添加剂，也是衡量食品卫生质量的重要指标。苯甲酸、山梨酸具有防腐保鲜的作用，糖精钠是合成甜味剂，甜度比蔗糖甜300-500倍。GB2760-2016《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对这三者的添加范围和限量都有明确的规定，超范围或者超限量使用都是违法的。GB5009.28-2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》对其检测方法做了规定，有高效液相色谱法和高效气相色谱法，其中高效液相色谱法为第一法仲裁法被广泛应用。国标方法在使用前要进行方法验证，核查实验室能否满足检测方法的要求。本研究针对高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的适用性、线性、检出限、定量限、加标回收率等进行了一一验证，均能够满足检测方法的要求。
一、仪器与试剂
1.仪器。高效液相色谱仪（紫外检测器，Y001），岛津LC-20AT；电子分析天平（Y033），BSA623S-CW，d=0.001g。
2.试剂。苯甲酸钠标准品（唯一性标识3422003，纯度100.0%），北京坛墨质检科技有限公司；山梨酸标准品（唯一性标识3192003，纯度99.9%），北京坛墨质检科技有限公司；糖精钠标準品（唯一性标识3212005，纯度99.5%），北京坛墨质检科技有限公司；甲醇（色谱级），Aigma-Aldrich；乙酸铵（色谱级），aladdin；亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；实验室用水为自制超纯水。
二、实验与方法
1.色谱条件。（1）色谱柱：Diamonsil Plus 5um C18，250×4.6mm；检测波长230nm；进样量10uL。（2）流动相：甲醇+乙酸铵溶液（0.02mol/L）=5+95；流速1mL/min。
2.样品前处理。准确称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min。冷却至室温后加入92g/L的亚铁氰化钾溶液2mL和183g/L的乙酸锌溶液2mL，混匀，于8000r/min离心5min。将水相转移至50mL容量瓶中，在残渣中加水20mL，涡旋混匀后超声5min，于8000r/min离心5min。将水相转移至同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22um滤膜，待液相色谱测定。
3.标准溶液配制。（1）苯甲酸、山梨酸、糖精钠（以糖精计）标准储备液（1000mg/L）：分别准确称取苯甲酸钠0.118g、山梨酸0.134g、糖精钠0.117g，用水溶解并定容至100mL，山梨酸用甲醇溶解定容。糖精钠含结晶水，使用前需在120℃条件下烘4h，再在干燥器中冷却至室温后备用。（2）苯甲酸、山梨酸、糖精钠（以糖精计）混合标准中间液（200mg/L）：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸、糖精钠（以糖精计）标准储备液各10mL，于50mL容量瓶中用水定容。
4.标准工作溶液的配制。线性指在适当的浓度范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度成比例关系的程度。用同一对照品储备液经精密稀释，或者分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5份不同浓度的对照品溶液。根据测得的响应信号对被测物的浓度作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。分别准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠混合标准中间溶液0mL、0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL和10.0mL，用水定容至10mL，配制成质量浓度分别为0mg/L、1.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L和200mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）混合标准系列工作溶液。以浓度对数为横坐标、以峰面积为纵坐标制作标准曲线，即y=kx+b。
5.检出限和定量限。检出限是指试样中被测物能被检出的最低量，定量限是指试样中被测物能被定量测定的最低量。一般验证是通过添加标准说明的检出限和定量限的标准物，然后进行测定，结果和标准给出的检出限和定量限差别在20%以内即认为符合要求。本实验通过添加检出限为0.005g/kg、定量限为0.01g/kg的苯甲酸、山梨酸和糖精钠，按照上述方法测定，并计算测定值和给出值的标准差。
6.精密度实验。精密度是指在规定条件下，同一份均匀供试品经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差来表示。在规定的范围内，取同一浓度的供试品，用至少测定6次的结果进行评价。本实验采用相对标准偏差来评价实验的准确性，精密度越小，平行性越好，准确度相对越高。将浓度为0.005g/ kg、0.01g/kg、1.25g/kg的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液重复测定7次，计算测定值的相对标准偏差和变异系数，评价其重复性。
7.加标回收实验。加标回收实验是化学分析中常用的分析方法，也是重要的质控手段，回收率是判定分析结果准确度的量化指标。本实验在东湖陈醋中加标，按照样品的处理步骤进行分析，得到的结果减去本底值后与理论值的比值为回收率。本实验精密称取2.0mL东湖陈醋共3份，置于50mL离心管中，分成3组，每组3份，加入高、低、中3种不同梯度浓度的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液0.1mg、1.0mg、2.0mg，按照上述样品处理方法处理，上机测定，根据公式计算得出平均回收率。
三、结果与分析
1.标准曲线、线性范围。如图1所示，苯甲酸、山梨酸、糖精钠在色谱中均有良好的响应，并能有效分离，效果良好。该方法的浓度范围为0-200μg/mL，线性方程和相关系数详见表1，相关系数均为0.9999，呈现良好线性。
2.检出限和定量限。从本方法检出限的验证结果（表2）和定量限的验证结果（表3）可以看出，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的偏差均在20%以内，说明该方法可行，检出限和定量限均符合要求。
3.样品检验结果。按照上述的實验方法对样品进行前处理，利用高效液相色谱仪进行检测，结果详见表4。从表 4可以看出，检测结果偏差均在0%-3.0%之间，符合标准规定的小于10%。
4.精密度实验。将浓度为0.005g/kg、0.01g/kg、1.25g/kg的标准品溶液重复进样7次，计算测定值的变异系数，结果详见表5。从表5可以看出，变异系数均小于7%，具有良好的精密度。精密度越小，重复性越高，实验数据越可靠。
5.加标回收实验。在样品中加入低、中、高3个水平标准溶液，从表6可知，回收率的范围为96.2%-106.2%，回收率较高，均在标准规定的80%-120%之间，说明该方法对食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定能起到很好的质量控制目的。
本研究建立了国标高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的验证方法。样品采用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，经过0.22um滤膜过滤，再经C18色谱柱分离，采用蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）检测。该方法在0-200μg/mL范围内以苯甲酸、山梨酸、糖精钠浓度的对数和对应峰面积做标准曲线，相关性良好（r2=0.9996）；平均加标回收率为99.6%-105.3%，方法检出限和定量限均符合国标方法要求。因此，该方法准确、灵敏，能够有效、快速地测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠。
作者简介：郝果，硕士，工程师；主要研究方向：食品安全分析检测。
一、仪器与试剂
1.仪器。高效液相色谱仪（紫外检测器，Y001），岛津LC-20AT；电子分析天平（Y033），BSA623S-CW，d=0.001g。
2.试剂。苯甲酸钠标准品（唯一性标识3422003，纯度100.0%），北京坛墨质检科技有限公司；山梨酸标准品（唯一性标识3192003，纯度99.9%），北京坛墨质检科技有限公司；糖精钠标準品（唯一性标识3212005，纯度99.5%），北京坛墨质检科技有限公司；甲醇（色谱级），Aigma-Aldrich；乙酸铵（色谱级），aladdin；亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；实验室用水为自制超纯水。
二、实验与方法
1.色谱条件。（1）色谱柱：Diamonsil Plus 5um C18，250×4.6mm；检测波长230nm；进样量10uL。（2）流动相：甲醇+乙酸铵溶液（0.02mol/L）=5+95；流速1mL/min。
2.样品前处理。准确称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min。冷却至室温后加入92g/L的亚铁氰化钾溶液2mL和183g/L的乙酸锌溶液2mL，混匀，于8000r/min离心5min。将水相转移至50mL容量瓶中，在残渣中加水20mL，涡旋混匀后超声5min，于8000r/min离心5min。将水相转移至同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22um滤膜，待液相色谱测定。
3.标准溶液配制。（1）苯甲酸、山梨酸、糖精钠（以糖精计）标准储备液（1000mg/L）：分别准确称取苯甲酸钠0.118g、山梨酸0.134g、糖精钠0.117g，用水溶解并定容至100mL，山梨酸用甲醇溶解定容。糖精钠含结晶水，使用前需在120℃条件下烘4h，再在干燥器中冷却至室温后备用。（2）苯甲酸、山梨酸、糖精钠（以糖精计）混合标准中间液（200mg/L）：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸、糖精钠（以糖精计）标准储备液各10mL，于50mL容量瓶中用水定容。
4.标准工作溶液的配制。线性指在适当的浓度范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度成比例关系的程度。用同一对照品储备液经精密稀释，或者分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5份不同浓度的对照品溶液。根据测得的响应信号对被测物的浓度作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。分别准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠混合标准中间溶液0mL、0.05mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL和10.0mL，用水定容至10mL，配制成质量浓度分别为0mg/L、1.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L和200mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）混合标准系列工作溶液。以浓度对数为横坐标、以峰面积为纵坐标制作标准曲线，即y=kx+b。
5.检出限和定量限。检出限是指试样中被测物能被检出的最低量，定量限是指试样中被测物能被定量测定的最低量。一般验证是通过添加标准说明的检出限和定量限的标准物，然后进行测定，结果和标准给出的检出限和定量限差别在20%以内即认为符合要求。本实验通过添加检出限为0.005g/kg、定量限为0.01g/kg的苯甲酸、山梨酸和糖精钠，按照上述方法测定，并计算测定值和给出值的标准差。
6.精密度实验。精密度是指在规定条件下，同一份均匀供试品经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差来表示。在规定的范围内，取同一浓度的供试品，用至少测定6次的结果进行评价。本实验采用相对标准偏差来评价实验的准确性，精密度越小，平行性越好，准确度相对越高。将浓度为0.005g/ kg、0.01g/kg、1.25g/kg的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液重复测定7次，计算测定值的相对标准偏差和变异系数，评价其重复性。
7.加标回收实验。加标回收实验是化学分析中常用的分析方法，也是重要的质控手段，回收率是判定分析结果准确度的量化指标。本实验在东湖陈醋中加标，按照样品的处理步骤进行分析，得到的结果减去本底值后与理论值的比值为回收率。本实验精密称取2.0mL东湖陈醋共3份，置于50mL离心管中，分成3组，每组3份，加入高、低、中3种不同梯度浓度的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液0.1mg、1.0mg、2.0mg，按照上述样品处理方法处理，上机测定，根据公式计算得出平均回收率。
三、结果与分析
1.标准曲线、线性范围。如图1所示，苯甲酸、山梨酸、糖精钠在色谱中均有良好的响应，并能有效分离，效果良好。该方法的浓度范围为0-200μg/mL，线性方程和相关系数详见表1，相关系数均为0.9999，呈现良好线性。
2.检出限和定量限。从本方法检出限的验证结果（表2）和定量限的验证结果（表3）可以看出，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的偏差均在20%以内，说明该方法可行，检出限和定量限均符合要求。
3.样品检验结果。按照上述的實验方法对样品进行前处理，利用高效液相色谱仪进行检测，结果详见表4。从表 4可以看出，检测结果偏差均在0%-3.0%之间，符合标准规定的小于10%。
4.精密度实验。将浓度为0.005g/kg、0.01g/kg、1.25g/kg的标准品溶液重复进样7次，计算测定值的变异系数，结果详见表5。从表5可以看出，变异系数均小于7%，具有良好的精密度。精密度越小，重复性越高，实验数据越可靠。
5.加标回收实验。在样品中加入低、中、高3个水平标准溶液，从表6可知，回收率的范围为96.2%-106.2%，回收率较高，均在标准规定的80%-120%之间，说明该方法对食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定能起到很好的质量控制目的。
本研究建立了国标高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的验证方法。样品采用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，经过0.22um滤膜过滤，再经C18色谱柱分离，采用蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）检测。该方法在0-200μg/mL范围内以苯甲酸、山梨酸、糖精钠浓度的对数和对应峰面积做标准曲线，相关性良好（r2=0.9996）；平均加标回收率为99.6%-105.3%，方法检出限和定量限均符合国标方法要求。因此，该方法准确、灵敏，能够有效、快速地测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠。
作者简介：郝果，硕士，工程师；主要研究方向：食品安全分析检测。