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摘要：目的：采用高效液相色谱法代替国家标准中TLC检测合成盐酸甲基麻黄碱相关物质，完善合成盐酸甲基麻黄碱质量标准。
方法：以苯基键合硅胶为固定相（Alltima色谱柱250×4.6mm），以0.15M醋酸盐缓冲液：甲醇（94∶6）用冰乙酸调节pH至4.0。检测波长257nm，流速1.0ml/ml。
结果：专属性，样品与对照分离度＞2.0；系统适用性,峰面积变化的RSD为1.1%；在10.13ug/ml～81.04 ug/ml范围内，线性关系良好（γ=0.9999）；重现性RSD为1.26%、耐用性符合要求、准确度性RSD为1.31%；HPLC法检测限为：0.004%；TLC法检测限为0.25%。
结论：方法快速、简便，重现性好，灵敏度高，可用于盐酸甲基麻黄碱相关物质检测。
关键词：高效液相色谱法 合成 盐酸甲基麻黄碱 相关物质
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.07.599
【中图分类号】R9【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2014)07-0369-01
盐酸甲基麻黄碱（Methylephedrine Hydrochloride）为拟肾上腺素药物，主要用于支气管哮喘，对急慢性支气管炎、上呼吸道炎、感冒等引起的咳嗽及荨麻疹等疾病有一定疗效。传统盐酸甲基黄碱的生产方法为以麻黄草为原料，采用提取方式而得，近年来，随着对麻黄草的过度采挖，草原沙化严重，麻黄草日益枯竭，为了保护生态环境，满足市场需求，赤峰艾克制药科技股份有限公司自主研发了用采用化学合成方法生产盐酸甲基麻黄碱的合成工艺。
为了更好地控制合成盐酸甲基麻黄碱的质量，本文建立了合成盐酸甲基麻黄碱相关物质的HPLC法，比目前国家药品标准中的TLC法在方法快速、简便，重现性好，灵敏度高。国内未见采用HPLC法测定合成盐酸甲基麻黄碱相关物质的文献报道。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪（包括600Pump，紫外检测器），CBM-102色谱工作站。
合成盐酸甲基麻黄碱样品（批号121121、121122、121123、120601）、盐酸甲基麻黄碱对照品（171242-200405）、盐酸麻黄碱对照品均由赤峰艾克制药科技股份有限公司提供，醋酸铵、甲醇、冰乙酸、氢氧化钠、盐酸、过氧化氢为分析纯，北京化学试剂公司。
2 色谱条件
色谱柱：苯基键合硅胶柱（Alltima色谱柱250×4.6mm）；流动相：0.15M醋酸盐缓冲液：甲醇（94∶6）用冰乙酸调节pH至4.0；检测波长257nm，流速1.0ml/ml。
3 方法与结果
3.1 方法专属性：考察起始原料（盐酸麻黄碱）与盐酸甲基麻黄碱的分离度大于2.0。
3.2 系统适用性：称取盐酸麻黄碱10.28mg与盐酸甲基麻黄碱10.20mg共置100ml量瓶内，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，进样20ul。
称取盐酸甲基麻黄碱25.17mg用流动相溶解并稀释至25ml，准确吸取1ml用流动相稀释至25ml。连续进样六次，计算峰面积变化的RSD值为1.1%。
3.3 线性关系考察：称取盐酸甲基麻黄碱对照品（171242-200405）101.30mg，用流动相溶解并稀释至100ml，进一步稀释成10.13ug/ml，20.26ug/ml、40.52ug/ml、60.78ug/ml、81.04ug/ml的溶液，各吸取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积。结果见下表1。
表1 盐酸甲基麻黄碱相关物质检测方法验证线性试验结果
浓度
10.13
20.26
40.52
60.78
81.04
峰面积
5068
9982
20077
29805
40428
线性方程
y=496.84x-66.5
相关系数
γ=0.9999
线性范围
10.13ug/ml～81.04 ug/ml
结果表明：在10.13ug/ml～81.04 ug/ml范围内，线性关系良好。
3.4 重现性：称取盐酸甲基麻黄碱对照品50.78mg，加流动相溶解并稀释至25ml，准确吸取0.5ml用流动相稀释至25ml，做为对照溶液。
样品溶液：精密称取样品约50mg，共九份，用流动相溶解并稀释至25ml，准确吸取0.4ml、0.5ml、0.6ml各三份，分别用流动相稀释至25ml。精密吸取对照品溶液与样品溶液各20ul进样，记录色谱峰面积。按外标法计算样品含量，RSD值为1.26%。
3.5 耐用性：采用不同色谱柱、不同流动相pH对方法系统适用性溶液进行检测，考察系统分离度、理论板数、不对称因子，综合评价后选定流动相PH值4.0最佳，但在4.0-4.5间均能满足试验要求；色谱柱ALLTIMA的3um150×4.6mm与5um250×4.6mm均可，但3um150×4.6mm分离效果更好。
样品溶液的制备：称取9份盐酸甲基麻黄碱样品约100mg，各加溶液（a）0.4ml、0.5ml、0.6ml各三份，用流动相稀释至25ml。
吸取对照品溶液与样品溶液各20ul进样，以外标法计算回收率，RSD值为1.31%。
样品溶液与对照品溶液各进样20ul，用外标法计算，结果见表2。
表2 盐酸甲基麻黄碱相关物质检测结果
批号
HPLC
TLC
麻黄碱%
其它单一杂质%
其它杂质总和%
杂质个数
杂质个数
杂质总和%
121121
＜0.005
0.05；0.03
0.08
2
0
＜0.25
121122
＜0.005
0.03；0.02
0.05
2
0
＜0.25
121123
＜0.005
0.07；0.03；0.01
0.11
3
0
＜0.25
120601
＜0.05
0.15；0.05；0.05
0.25
3
0
＜0.25
4 讨论
4.1 在波长选择中，在200nm-400nm间扫描，有三个最大吸收峰251nm、257nm及263nm。选择最大吸收峰257nm做为测定波长。
4.2 通过2种方法比较，HPLC法检测限为：0.004%；TLC法检测限为0.25%，HPLC法灵敏度明显好于TLC法。
4.3 由于盐酸甲基麻黄碱起始物料为盐酸麻黄碱，因此相关物质中盐酸麻黄碱作为对照测定分离度。
4.4 根据以上结果，可采用采用HPLC法测定相关物质，标准制订为：盐酸麻黄碱≤1.0%；其它单一杂质≤0.5%；其它杂质总和≤1.0%。
参考文献
[1] 国家药品标准：WS-10001-（HD-0459）-2002
[2] ChP（中国药典）2010.vol Ⅱ（二部）：附录VD
方法：以苯基键合硅胶为固定相（Alltima色谱柱250×4.6mm），以0.15M醋酸盐缓冲液：甲醇（94∶6）用冰乙酸调节pH至4.0。检测波长257nm，流速1.0ml/ml。
结果：专属性，样品与对照分离度＞2.0；系统适用性,峰面积变化的RSD为1.1%；在10.13ug/ml～81.04 ug/ml范围内，线性关系良好（γ=0.9999）；重现性RSD为1.26%、耐用性符合要求、准确度性RSD为1.31%；HPLC法检测限为：0.004%；TLC法检测限为0.25%。
结论：方法快速、简便，重现性好，灵敏度高，可用于盐酸甲基麻黄碱相关物质检测。
关键词：高效液相色谱法 合成 盐酸甲基麻黄碱 相关物质
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.07.599
【中图分类号】R9【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2014)07-0369-01
盐酸甲基麻黄碱（Methylephedrine Hydrochloride）为拟肾上腺素药物，主要用于支气管哮喘，对急慢性支气管炎、上呼吸道炎、感冒等引起的咳嗽及荨麻疹等疾病有一定疗效。传统盐酸甲基黄碱的生产方法为以麻黄草为原料，采用提取方式而得，近年来，随着对麻黄草的过度采挖，草原沙化严重，麻黄草日益枯竭，为了保护生态环境，满足市场需求，赤峰艾克制药科技股份有限公司自主研发了用采用化学合成方法生产盐酸甲基麻黄碱的合成工艺。
为了更好地控制合成盐酸甲基麻黄碱的质量，本文建立了合成盐酸甲基麻黄碱相关物质的HPLC法，比目前国家药品标准中的TLC法在方法快速、简便，重现性好，灵敏度高。国内未见采用HPLC法测定合成盐酸甲基麻黄碱相关物质的文献报道。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪（包括600Pump，紫外检测器），CBM-102色谱工作站。
合成盐酸甲基麻黄碱样品（批号121121、121122、121123、120601）、盐酸甲基麻黄碱对照品（171242-200405）、盐酸麻黄碱对照品均由赤峰艾克制药科技股份有限公司提供，醋酸铵、甲醇、冰乙酸、氢氧化钠、盐酸、过氧化氢为分析纯，北京化学试剂公司。
2 色谱条件
色谱柱：苯基键合硅胶柱（Alltima色谱柱250×4.6mm）；流动相：0.15M醋酸盐缓冲液：甲醇（94∶6）用冰乙酸调节pH至4.0；检测波长257nm，流速1.0ml/ml。
3 方法与结果
3.1 方法专属性：考察起始原料（盐酸麻黄碱）与盐酸甲基麻黄碱的分离度大于2.0。
3.2 系统适用性：称取盐酸麻黄碱10.28mg与盐酸甲基麻黄碱10.20mg共置100ml量瓶内，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，进样20ul。
称取盐酸甲基麻黄碱25.17mg用流动相溶解并稀释至25ml，准确吸取1ml用流动相稀释至25ml。连续进样六次，计算峰面积变化的RSD值为1.1%。
3.3 线性关系考察：称取盐酸甲基麻黄碱对照品（171242-200405）101.30mg，用流动相溶解并稀释至100ml，进一步稀释成10.13ug/ml，20.26ug/ml、40.52ug/ml、60.78ug/ml、81.04ug/ml的溶液，各吸取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积。结果见下表1。
表1 盐酸甲基麻黄碱相关物质检测方法验证线性试验结果
浓度
10.13
20.26
40.52
60.78
81.04
峰面积
5068
9982
20077
29805
40428
线性方程
y=496.84x-66.5
相关系数
γ=0.9999
线性范围
10.13ug/ml～81.04 ug/ml
结果表明：在10.13ug/ml～81.04 ug/ml范围内，线性关系良好。
3.4 重现性：称取盐酸甲基麻黄碱对照品50.78mg，加流动相溶解并稀释至25ml，准确吸取0.5ml用流动相稀释至25ml，做为对照溶液。
样品溶液：精密称取样品约50mg，共九份，用流动相溶解并稀释至25ml，准确吸取0.4ml、0.5ml、0.6ml各三份，分别用流动相稀释至25ml。精密吸取对照品溶液与样品溶液各20ul进样，记录色谱峰面积。按外标法计算样品含量，RSD值为1.26%。
3.5 耐用性：采用不同色谱柱、不同流动相pH对方法系统适用性溶液进行检测，考察系统分离度、理论板数、不对称因子，综合评价后选定流动相PH值4.0最佳，但在4.0-4.5间均能满足试验要求；色谱柱ALLTIMA的3um150×4.6mm与5um250×4.6mm均可，但3um150×4.6mm分离效果更好。
样品溶液的制备：称取9份盐酸甲基麻黄碱样品约100mg，各加溶液（a）0.4ml、0.5ml、0.6ml各三份，用流动相稀释至25ml。
吸取对照品溶液与样品溶液各20ul进样，以外标法计算回收率，RSD值为1.31%。
样品溶液与对照品溶液各进样20ul，用外标法计算，结果见表2。
表2 盐酸甲基麻黄碱相关物质检测结果
批号
HPLC
TLC
麻黄碱%
其它单一杂质%
其它杂质总和%
杂质个数
杂质个数
杂质总和%
121121
＜0.005
0.05；0.03
0.08
2
0
＜0.25
121122
＜0.005
0.03；0.02
0.05
2
0
＜0.25
121123
＜0.005
0.07；0.03；0.01
0.11
3
0
＜0.25
120601
＜0.05
0.15；0.05；0.05
0.25
3
0
＜0.25
4 讨论
4.1 在波长选择中，在200nm-400nm间扫描，有三个最大吸收峰251nm、257nm及263nm。选择最大吸收峰257nm做为测定波长。
4.2 通过2种方法比较，HPLC法检测限为：0.004%；TLC法检测限为0.25%，HPLC法灵敏度明显好于TLC法。
4.3 由于盐酸甲基麻黄碱起始物料为盐酸麻黄碱，因此相关物质中盐酸麻黄碱作为对照测定分离度。
4.4 根据以上结果，可采用采用HPLC法测定相关物质，标准制订为：盐酸麻黄碱≤1.0%；其它单一杂质≤0.5%；其它杂质总和≤1.0%。
参考文献
[1] 国家药品标准：WS-10001-（HD-0459）-2002
[2] ChP（中国药典）2010.vol Ⅱ（二部）：附录VD