猪肉腌制过程中肌内ATGL、HSL磷酸化与甘油三酯水解研究

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干腌是肉制品加工过程中的一种重要手段。而在肉品干腌过程中食盐是最主要的腌制剂,添加食盐对肉制品的质地和风味等品质会产生重要影响。在肉品腌制过程中随着食盐的渗入和扩散,肌肉的结构和化学成分会发生系列变化,如脂质的水解氧化、蛋白质的水解氧化等。许多研究表明,脂肪在肉类腌制过程中会发生水解与氧化,对腌制肉制品风味的形成有非常重要的贡献。但是,到目前为止,关于腌制过程中食盐对肌内脂质水解的作用机制及其相关调控机理还不清楚。为探明这一问题,本研究以屠宰新鲜猪后腿股二头肌肌肉作为实验材料,在4℃的条件下对其进行不同浓度食盐(0%、1%、3%、5%)的腌制,腌制时间为3 d。首先研究了腌制过程中食盐对肌内甘油三酯水解变化规律之间的影响,其次研究食盐对肌内脂肪细胞中蛋白磷酸化的影响,最后研究了食盐对肌内脂肪细胞中脂滴相关调控蛋白PLIN1、ABHD5和G0S2磷酸化的影响。其主要研究内容及结果如下:(1)采用不同浓度食盐对肌肉进行腌制,分析肌肉内Na Cl含量、水分含量及水分存在状态等基本理化指标,观察不同腌制条件下肌肉内的微观结构及分析脂肪细胞形态变化与肌内甘油三酯水解规律之间的关系。结果表明:在干腌猪肉加工过程中盐浓度的增加可显著降低不易流动水(T21)的弛豫时间(P<0.05);而且随着盐浓度的增加,肌内甘油含量先增加再减少,在3%食盐处理组时肌内甘油含量最高为1.18 mg/g,此时甘油三酯含量最低为1.90 mg/g;而且在整个腌制过程中,3%食盐处理组内总甘油三酯水解酶活性最高,其次是5%食盐处理组和1%食盐处理组,因此3%食盐添加量是腌制过程中的一个拐点;另外通过Western Blotting发现随着盐浓度的增加,ATGL(adipose triglyceride lipase)、HSL(hormone-sensitive lipase)及其磷酸化蛋白表达量均明显增加,并且微观结构分析也表明随着盐浓度的增加,肌内脂肪发生显著水解,脂滴由大脂滴裂解生成小脂滴,且数量减少。(2)提取腌制过程中不同处理组肌肉中的脂肪细胞及细胞内总蛋白,分析观察细胞内甘油三酯水解变化与细胞内脂滴的形态和数量之间的相关性及细胞内蛋白激酶(protein kinase,PKA、AMPK)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化以及胞浆内蛋白质整体磷酸化程度与腌制用盐量之间的相关性。结果表明:在干腌肉制品加工过程中,随着盐浓度的增加,PKA、AMPK以及ALP活性先增加再减少,在3%食盐处理组时酶活性最高,引起脂滴相关蛋白发生磷酸化作用于内源性脂肪酶,从而加速细胞内甘油酯的水解;而且还通过Western Blotting检测到细胞内含有ATGL、HSL及其磷酸化蛋白表达量;然后利用SDS-PAGE电泳与Pro-Q Diamond荧光染色相结合的方法,测得在整个食盐腌制过程中细胞内整体磷酸化水平受到食盐浓度的影响,并且在3%食盐处理组时细胞内整体磷酸化水平最高。(3)通过提取不同腌制条件下各处理组中的脂肪细胞及细胞内总蛋白质,研究腌制过程中细胞内脂滴相关蛋白(Perilipin 1,PLIN1;α/βhydrolase domain-containing 5,ABHD5;G0/G1 switch gene 2 protein,G0S2蛋白)及细胞内甘油三酯水解程度与不同食盐浓度之间的相关性。研究结果表明:在整个腌制过程中,随着盐浓度的增加,脂肪细胞内甘油含量和总甘油三酯水解酶活性先增加再减少,在3%食盐处理组时细胞内甘油含量和总甘油三酯水解酶活性最高,但细胞内甘油三酯含量最低,表明3%食盐浓度可显著增加细胞内总甘油酯水解酶活性(P<0.05),从而加速细胞内甘油酯的水解。而且通过Western Blotting还检测到细胞内含有脂滴相关蛋白PLIN1、ABHD5和G0S2蛋白,并测得其蛋白表达量。发现腌制3天、3%食盐时,细胞内PLIN1和ABHD5的蛋白表达量最高,而G0S2蛋白的蛋白表达量最低,说明加入3%食盐能显著增加细胞内PKA活性和总蛋白磷酸化水平,使得PLIN1磷酸化激活ATGL,导致细胞内甘油酯发生水解。
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