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摘要：目的 建立珠芪复肝颗粒中珠子草的鉴别和没食子酸的含量测定方法。方法 采用薄层色谱法对珠子草进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定没食子酸的含量，以C18柱分离，柱温为室温，甲醇-0.1%磷酸水溶液（10∶90）为流动相，检测波长为270 nm，流速1.0 mL/min。结果 薄层色谱中能鉴别出珠子草。没食子酸的线性范围为0.0033～0.025 0 ?g（r=0.999 9），平均回收率为100.08%（RSD=1.24%，n=5）。结论 所建立的方法简便、重复性好，可用于珠芪复肝颗粒中珠子草的鉴别和没食子酸的含量测定。
关键词：珠芪复肝颗粒；珠子草；没食子酸；薄层色谱法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0047-02
珠芪复肝颗粒（珠子草、黄芪、甘草等）为兰州市第二人民医院院内制剂（甘药制字Z04010909），有清热解毒、舒肝利胆、扶正祛邪之功效，临床用于乙型病毒性肝炎的治疗。为了控制本品质量，本研究应用薄层色谱法（TLC）鉴别制剂中的珠子草，采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中主药珠子草所含有效成分没食子酸的含量。
1 仪器与试药
岛津LC-10AVP高效液相色谱仪（包括SPD-10AVP二极管阵列检测器、LC-10AT二元泵、C-R10A色谱工作站）；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；CQX25-12超声波提取器（上海必能信超有限公司）。
没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号0731- 9501，供含量测定用）；珠子草对照药材（中国药品生物制品检定所，批号121319-200301，供鉴别用）；珠芪复肝颗粒（兰州市第二人民医院制剂室，批号20090601、20090604、20090607、20090609、20090612，每包10 g）；薄层层析硅胶G板（中国青岛海洋化工集团出品）；甲醇为色谱纯（天津光夏精细化工厂研究所）；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
取珠芪复肝颗粒约1 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理10 min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取珠子草对照药材0.5 g，加甲醇10 mL，如上法操作，滤液作为对照药材溶液。照TLC试验[1-2]，吸取上述溶液各5 ?L分别点于硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（20∶5∶5）上行展开、取出、挥干溶剂，喷10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。日光下检视，样品供试液色谱中在与对照药材色谱相应的位置上有相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱为ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：A为甲醇，B为0.1%磷酸水溶液。梯度洗脱条件：0～15 min，A-B（10∶90）；15～17 min，A-B（90∶10）；17～35 min， A-B（10∶90）。流速1.0 mL/min；柱温为室温；检测波长为270 nm。理论塔板数按没食子酸计算不低于5 000。
在此色谱条件下，供试品中没食子酸峰分离良好，阴性对照对没食子酸的测定无干扰。色谱图见图1。
2.2.2 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加30%甲醇制成每1 mL含41.6 ?g的溶液即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品2 g，研细，取约0.5 g，精密称定，置250 mL容量瓶中，加入30%甲醇溶液约250 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，取出放冷，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液再经0.45 ?m微孔滤膜过滤后，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除珠子草以外的其他药材，按珠芪复肝颗粒的制备工艺和供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 线性范围考察 分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.1、0.2、0.25、0.5、0.75 mL，分别置25 mL容量瓶中，用30%甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样20 ?L，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（?g）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=62 059.84X-35 650.77，r=0.999 9。结果表明，没食子酸在0.003 3～0.025 0 ?g范围内呈良好线性关系。
2.2.6 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液20 ?L，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，重复进样测定5次，以外标法计算没食子酸含量。结果没食子酸平均含量为3.85 mg/g， RSD=0.71%，表明本方法仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12 h依样品测定法测定，考察没食子酸峰面积的变化。结果没食子酸含量RSD=0.84%，可见，供试品溶液在室温放置12 h稳定性良好。
2.2.8 重复性试验 精密称取同一批号（20090601）的5份样品，制成5份供试品溶液，精密吸取10 ?L，注入高效液相色谱仪，测定没食子酸的含量。结果没食子酸含量RSD=0.35%，重复性良好。
2.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品（20090601）0.2 g，研细，分别精确加入没食子酸对照品溶液（0.44 mg/mL）1.0 mL，制成供试品溶液，依法测定没食子酸含量，计算回收率。结果见表1。
3 讨论
珠子草为叶下珠属植物珠子草（Phyllanthus niruri Linn）的干燥全草，具有平肝清热、利水解毒之功效，用于肠炎、肝炎、痢疾、尿路感染、无名肿痛等治疗。多酚和可水解蹂质为叶下珠类的主要活性成分，没食子酸的含量最高，具有抗乙肝病毒活性的作用[3-4]。
本试验在确定检测波长时对没食子酸对照品在200～300 nm波长之间进行全波段紫外扫描。结果没食子酸在270 nm波长处有最大吸收，随着波长增长，紫外吸收急剧降低，故最终选择270 nm为检测波长。
本试验在提取工艺考察中，采取浸渍、超声法与加热回流法，结果表明以超声法提取的供品溶液没食子酸峰的峰面积较稳定，重复性较好。本试验对超声提取时间进行了比较，样品分别超声15、30、60 min在同样条件下测定，结果超声30 min的峰面积最大，故选择超声时间为30 min。
本试验考察了甲醇-水-磷酸（4∶96∶0.5）[3]、醋酸-水（2∶98）、甲醇-水-磷酸（20∶80∶0.5）、甲醇-0.01%磷酸溶液（10∶90）等作流动相时对药物分离的影响。结果发现，以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相梯度洗脱，其分离效果最好，色谱峰形对称。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录34.
[2] 李彩东，田薇，梁云，等.复方苦味叶下珠胶囊的制备及质量控制[J].中国药房，2005，16（7）：511-513.
[3] 张兰珍，王晓强，贾辉，等.高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量[J].北京中医药大学学报，2000，23（6）：46-47.
[4] Liu SP， Chen SM， Zhu WD. Advance studies of biological activity of quercetin and its derivations[J]. Chin Tradit Herb Drugs，1991，22：182.
（收稿日期：2011-08-19，编辑：陈静）
关键词：珠芪复肝颗粒；珠子草；没食子酸；薄层色谱法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0047-02
珠芪复肝颗粒（珠子草、黄芪、甘草等）为兰州市第二人民医院院内制剂（甘药制字Z04010909），有清热解毒、舒肝利胆、扶正祛邪之功效，临床用于乙型病毒性肝炎的治疗。为了控制本品质量，本研究应用薄层色谱法（TLC）鉴别制剂中的珠子草，采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中主药珠子草所含有效成分没食子酸的含量。
1 仪器与试药
岛津LC-10AVP高效液相色谱仪（包括SPD-10AVP二极管阵列检测器、LC-10AT二元泵、C-R10A色谱工作站）；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；CQX25-12超声波提取器（上海必能信超有限公司）。
没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号0731- 9501，供含量测定用）；珠子草对照药材（中国药品生物制品检定所，批号121319-200301，供鉴别用）；珠芪复肝颗粒（兰州市第二人民医院制剂室，批号20090601、20090604、20090607、20090609、20090612，每包10 g）；薄层层析硅胶G板（中国青岛海洋化工集团出品）；甲醇为色谱纯（天津光夏精细化工厂研究所）；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
取珠芪复肝颗粒约1 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理10 min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取珠子草对照药材0.5 g，加甲醇10 mL，如上法操作，滤液作为对照药材溶液。照TLC试验[1-2]，吸取上述溶液各5 ?L分别点于硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（20∶5∶5）上行展开、取出、挥干溶剂，喷10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。日光下检视，样品供试液色谱中在与对照药材色谱相应的位置上有相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱为ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：A为甲醇，B为0.1%磷酸水溶液。梯度洗脱条件：0～15 min，A-B（10∶90）；15～17 min，A-B（90∶10）；17～35 min， A-B（10∶90）。流速1.0 mL/min；柱温为室温；检测波长为270 nm。理论塔板数按没食子酸计算不低于5 000。
在此色谱条件下，供试品中没食子酸峰分离良好，阴性对照对没食子酸的测定无干扰。色谱图见图1。
2.2.2 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加30%甲醇制成每1 mL含41.6 ?g的溶液即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品2 g，研细，取约0.5 g，精密称定，置250 mL容量瓶中，加入30%甲醇溶液约250 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，取出放冷，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液再经0.45 ?m微孔滤膜过滤后，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除珠子草以外的其他药材，按珠芪复肝颗粒的制备工艺和供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 线性范围考察 分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.1、0.2、0.25、0.5、0.75 mL，分别置25 mL容量瓶中，用30%甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样20 ?L，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（?g）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=62 059.84X-35 650.77，r=0.999 9。结果表明，没食子酸在0.003 3～0.025 0 ?g范围内呈良好线性关系。
2.2.6 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液20 ?L，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，重复进样测定5次，以外标法计算没食子酸含量。结果没食子酸平均含量为3.85 mg/g， RSD=0.71%，表明本方法仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12 h依样品测定法测定，考察没食子酸峰面积的变化。结果没食子酸含量RSD=0.84%，可见，供试品溶液在室温放置12 h稳定性良好。
2.2.8 重复性试验 精密称取同一批号（20090601）的5份样品，制成5份供试品溶液，精密吸取10 ?L，注入高效液相色谱仪，测定没食子酸的含量。结果没食子酸含量RSD=0.35%，重复性良好。
2.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品（20090601）0.2 g，研细，分别精确加入没食子酸对照品溶液（0.44 mg/mL）1.0 mL，制成供试品溶液，依法测定没食子酸含量，计算回收率。结果见表1。
3 讨论
珠子草为叶下珠属植物珠子草（Phyllanthus niruri Linn）的干燥全草，具有平肝清热、利水解毒之功效，用于肠炎、肝炎、痢疾、尿路感染、无名肿痛等治疗。多酚和可水解蹂质为叶下珠类的主要活性成分，没食子酸的含量最高，具有抗乙肝病毒活性的作用[3-4]。
本试验在确定检测波长时对没食子酸对照品在200～300 nm波长之间进行全波段紫外扫描。结果没食子酸在270 nm波长处有最大吸收，随着波长增长，紫外吸收急剧降低，故最终选择270 nm为检测波长。
本试验在提取工艺考察中，采取浸渍、超声法与加热回流法，结果表明以超声法提取的供品溶液没食子酸峰的峰面积较稳定，重复性较好。本试验对超声提取时间进行了比较，样品分别超声15、30、60 min在同样条件下测定，结果超声30 min的峰面积最大，故选择超声时间为30 min。
本试验考察了甲醇-水-磷酸（4∶96∶0.5）[3]、醋酸-水（2∶98）、甲醇-水-磷酸（20∶80∶0.5）、甲醇-0.01%磷酸溶液（10∶90）等作流动相时对药物分离的影响。结果发现，以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相梯度洗脱，其分离效果最好，色谱峰形对称。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录34.
[2] 李彩东，田薇，梁云，等.复方苦味叶下珠胶囊的制备及质量控制[J].中国药房，2005，16（7）：511-513.
[3] 张兰珍，王晓强，贾辉，等.高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量[J].北京中医药大学学报，2000，23（6）：46-47.
[4] Liu SP， Chen SM， Zhu WD. Advance studies of biological activity of quercetin and its derivations[J]. Chin Tradit Herb Drugs，1991，22：182.
（收稿日期：2011-08-19，编辑：陈静）