论文部分内容阅读
摘要：目的：观察survivin-siRNA对U87人胶质瘤细胞生长的抑制效果。
方法：培养U87人胶质瘤细胞，构建siRNA质粒，将构建的质粒与细胞共同培养，实验分为空白对照组（培养基中加PBS，pH7.4）、单纯质粒组、对照基因质粒（Si-M）组，Survivin-siRNA质粒（Si-S）组，通过Western blot 蛋白印迹分析、细胞生长曲线实验、细胞凋亡试验等方法观察其对胶质瘤的抑制作用。
结果：Si-S质粒组细胞生存素mRNA和蛋白水平均降低；与其他组相比，Si-S质粒组U87胶质瘤细胞增生明显受到抑制（P<0.001）；Si-S质粒组细胞凋亡数量明显高于对照组，与其他组相比Si-S组生存素水平降低更能诱导细胞凋亡（P<0.001）。
结论：survivin-siRNA可在体外相同培养条件下明显抑制U87细胞的生长，抑制其survivin mRNA的转录，减少其蛋白水平的表达。
关键词：Survivin小干扰RNAU87人胶质瘤细胞体外培养抑制
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2014）05-0001-01
目前针对胶质瘤的治疗方案较多，其中干扰RNA技术可以沉默肿瘤的特殊基因而达到抑制肿瘤生长和增殖的作用，体内和体外的实验都证实了这是一种行之有效的治疗策略[1]。Survivin基因在正常的成年组织中低表达，而在患者中高表达意味着生存期短，预后差，治疗抵抗，瘤细胞快速增殖[2]。抑制survivin基因的表达可能作为一种新的治疗方案对抗胶质瘤[3]。我们研究的目的是观察survivin-siRNA在体外实验环境下对U87人胶质瘤细胞生长的抑制效果。
1材料与方法
1.1细胞培养：采用U87人胶质瘤细胞系（购于中国医学科学院基础医学研究所），种于培养基（MEM）添加10%胎牛血清，在5%CO2、37℃培养箱中培养，待细胞长至80%融合时进行实验处理。
1.2设计siRNA与siRNA质粒的构建。Survivin-siRNA由Takara 宝生物工程有限公司合成。人Survivin-siRNA设计克隆采用siLentGeneTM U6试剂盒（购于Promega，Madison，WI，USA），具体步骤按说明书完成。
1.3Western blot 蛋白印迹分析。人U87胶质瘤细胞在六孔培养皿中37℃培养24小时，分为空白对照组（培养基中加PBS，pH 7.4）、单纯质粒组，Si-M组，Si-S组。每组蛋白样品的浓度应用BCA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测，具体步骤按说明书进行。兔survivin单克隆抗体和β-actin单克隆抗体购于Signaling Technology，Danvers，MA，USA。辣根过氧化物酶购于Cell Signaling Technology。结果在增强化学发光系统（GE Healthcare）和Bio-Rad Gel DocTM XR拍照系统下观察。
1.4U87细胞生长曲线实验。人U87胶质瘤细胞种植在24孔培养板中，每孔数量为2 × 104个细胞，过夜细胞贴壁后按上述方案分组处理细胞。6天中每24小时应用0.01molPBS清洗两次，将MMT加入每个培养孔中，浓度为0.5mg/ml，然后将培养板37°C培养4小时，培养液取出后，每孔中加入15分钟后。在490nm下检测样品的吸光度。总细胞数由标准曲线计算得出。
1.5U87细胞克隆试验。人U87胶质瘤细胞种植在24孔培养板中，每孔数量为100个细胞，培养24h，按上述方案分组处理细胞，10天后，固定并计数克隆细胞。
1.6U87细胞凋亡试验。细胞处理方案同上。72h后，收集细胞，用0.01M冷PBS（PH7.4）洗涤。采用FITC/PI双重染色法检测凋亡细胞，试剂盒购自Roche公司，操作按说明书进行。细胞分析使用FACSCaliburTM流式细胞术系统。
1.7统计学分析。计量资料用X±S表示，数据采用SPSS18.0软件进行统计，两组比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1生存素体外抑制试验。Western blot实验结果显示：体外转染Si-S质粒的细胞生存素mRNA和蛋白水平均降低。
2.2U87细胞体外生长与增殖。MTT试验和克隆形成试验结果显示，与空白对照组和Si-M质粒组相比，Si-S质粒组U87胶质瘤细胞增生明显受到抑制。与对照组细胞相比，Si-S组细胞增生受到明显抑制（P<0.001）。
2.3U87细胞凋亡。转染Si-S质粒的细胞凋亡数量明显高于对照组，与其他组相比Si-S组组生存素水平降低更能诱导细胞凋亡（P<0.001）。
3讨论
目前，分子治疗如运用RNAi治疗脑胶质瘤引起医学界的广泛关注[1]。编码survivin 的基因，是一种凋亡抑制基因，被视为分子基因靶向治疗脑胶质瘤最受关注的癌基因。本研究旨在探讨survivin-siRNA在体外对U87人胶质母细胞瘤的抑制效果。Survivin在神经胶质瘤中频繁、过度表达与存活率、预后、治疗抵抗和肿瘤复发密切相关[4]。介于survivin在肿瘤发展中的重要性，它已成为基因治疗的一个靶点。Survivin在结肠直肠癌中被确定为siRNA的靶点，siRNA首次应用就减少了结肠癌细胞的增殖，降低癌细胞在体外的生存率并使裸鼠肿瘤体积减小。使用siRNA还能抑制人类胰腺癌细胞株Panc-1和BxPC3，通过非特异性地降低surviving mRNA和蛋白质，抑制细胞生长，促进凋亡和特异性地捕获G0/G1[5]。此外，siRNA还可以显著提高胰腺癌肿瘤细胞对胞苷的敏感性[5]。本研究显示survivin-siRNA可抑制survivin mRNA和蛋白水平。
总之，本研究表明survivin-siRNA可在体外相同培养条件下明显抑制U87细胞的生长，抑制其survivin mRNA的转录，减少其蛋白水平的表达，可能为脑胶质瘤的治疗提供可靠实验室研究资料。
参考文献
[1]Zimmermann TS，Lee AC，Akinc A，et al.RNAi-mediated gene silencing in non-human primates.Nature，2006，441： 111-114
[2]Yang H，Fu JH，Hu Y，et al.Influence of SiRNA targeting survivin on chemosensitivity of H460/cDDP lung cancer cells.J Int Med Res，2008，36： 734-747
[3]Liu Q，Fu H，Xing R，et al.Survivin knockdown combined with apoptin overexpression inhibits cell growth significantly.Cancer Biol Ther.2008，7：1053-1060
[4]Pardridge WM.shRNA and siRNA delivery to the brain.Adv Drug Deliv Rev，2007，59： 141-152
[5]Liu WS，Yan HJ，Qin RY，et al： siRNA directed against survivin enhances pancreatic cancer cell gemcitabine chemosensitivity.Dig Dis Sci，2009，54： 89-96
方法：培养U87人胶质瘤细胞，构建siRNA质粒，将构建的质粒与细胞共同培养，实验分为空白对照组（培养基中加PBS，pH7.4）、单纯质粒组、对照基因质粒（Si-M）组，Survivin-siRNA质粒（Si-S）组，通过Western blot 蛋白印迹分析、细胞生长曲线实验、细胞凋亡试验等方法观察其对胶质瘤的抑制作用。
结果：Si-S质粒组细胞生存素mRNA和蛋白水平均降低；与其他组相比，Si-S质粒组U87胶质瘤细胞增生明显受到抑制（P<0.001）；Si-S质粒组细胞凋亡数量明显高于对照组，与其他组相比Si-S组生存素水平降低更能诱导细胞凋亡（P<0.001）。
结论：survivin-siRNA可在体外相同培养条件下明显抑制U87细胞的生长，抑制其survivin mRNA的转录，减少其蛋白水平的表达。
关键词：Survivin小干扰RNAU87人胶质瘤细胞体外培养抑制
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2014）05-0001-01
目前针对胶质瘤的治疗方案较多，其中干扰RNA技术可以沉默肿瘤的特殊基因而达到抑制肿瘤生长和增殖的作用，体内和体外的实验都证实了这是一种行之有效的治疗策略[1]。Survivin基因在正常的成年组织中低表达，而在患者中高表达意味着生存期短，预后差，治疗抵抗，瘤细胞快速增殖[2]。抑制survivin基因的表达可能作为一种新的治疗方案对抗胶质瘤[3]。我们研究的目的是观察survivin-siRNA在体外实验环境下对U87人胶质瘤细胞生长的抑制效果。
1材料与方法
1.1细胞培养：采用U87人胶质瘤细胞系（购于中国医学科学院基础医学研究所），种于培养基（MEM）添加10%胎牛血清，在5%CO2、37℃培养箱中培养，待细胞长至80%融合时进行实验处理。
1.2设计siRNA与siRNA质粒的构建。Survivin-siRNA由Takara 宝生物工程有限公司合成。人Survivin-siRNA设计克隆采用siLentGeneTM U6试剂盒（购于Promega，Madison，WI，USA），具体步骤按说明书完成。
1.3Western blot 蛋白印迹分析。人U87胶质瘤细胞在六孔培养皿中37℃培养24小时，分为空白对照组（培养基中加PBS，pH 7.4）、单纯质粒组，Si-M组，Si-S组。每组蛋白样品的浓度应用BCA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测，具体步骤按说明书进行。兔survivin单克隆抗体和β-actin单克隆抗体购于Signaling Technology，Danvers，MA，USA。辣根过氧化物酶购于Cell Signaling Technology。结果在增强化学发光系统（GE Healthcare）和Bio-Rad Gel DocTM XR拍照系统下观察。
1.4U87细胞生长曲线实验。人U87胶质瘤细胞种植在24孔培养板中，每孔数量为2 × 104个细胞，过夜细胞贴壁后按上述方案分组处理细胞。6天中每24小时应用0.01molPBS清洗两次，将MMT加入每个培养孔中，浓度为0.5mg/ml，然后将培养板37°C培养4小时，培养液取出后，每孔中加入15分钟后。在490nm下检测样品的吸光度。总细胞数由标准曲线计算得出。
1.5U87细胞克隆试验。人U87胶质瘤细胞种植在24孔培养板中，每孔数量为100个细胞，培养24h，按上述方案分组处理细胞，10天后，固定并计数克隆细胞。
1.6U87细胞凋亡试验。细胞处理方案同上。72h后，收集细胞，用0.01M冷PBS（PH7.4）洗涤。采用FITC/PI双重染色法检测凋亡细胞，试剂盒购自Roche公司，操作按说明书进行。细胞分析使用FACSCaliburTM流式细胞术系统。
1.7统计学分析。计量资料用X±S表示，数据采用SPSS18.0软件进行统计，两组比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1生存素体外抑制试验。Western blot实验结果显示：体外转染Si-S质粒的细胞生存素mRNA和蛋白水平均降低。
2.2U87细胞体外生长与增殖。MTT试验和克隆形成试验结果显示，与空白对照组和Si-M质粒组相比，Si-S质粒组U87胶质瘤细胞增生明显受到抑制。与对照组细胞相比，Si-S组细胞增生受到明显抑制（P<0.001）。
2.3U87细胞凋亡。转染Si-S质粒的细胞凋亡数量明显高于对照组，与其他组相比Si-S组组生存素水平降低更能诱导细胞凋亡（P<0.001）。
3讨论
目前，分子治疗如运用RNAi治疗脑胶质瘤引起医学界的广泛关注[1]。编码survivin 的基因，是一种凋亡抑制基因，被视为分子基因靶向治疗脑胶质瘤最受关注的癌基因。本研究旨在探讨survivin-siRNA在体外对U87人胶质母细胞瘤的抑制效果。Survivin在神经胶质瘤中频繁、过度表达与存活率、预后、治疗抵抗和肿瘤复发密切相关[4]。介于survivin在肿瘤发展中的重要性，它已成为基因治疗的一个靶点。Survivin在结肠直肠癌中被确定为siRNA的靶点，siRNA首次应用就减少了结肠癌细胞的增殖，降低癌细胞在体外的生存率并使裸鼠肿瘤体积减小。使用siRNA还能抑制人类胰腺癌细胞株Panc-1和BxPC3，通过非特异性地降低surviving mRNA和蛋白质，抑制细胞生长，促进凋亡和特异性地捕获G0/G1[5]。此外，siRNA还可以显著提高胰腺癌肿瘤细胞对胞苷的敏感性[5]。本研究显示survivin-siRNA可抑制survivin mRNA和蛋白水平。
总之，本研究表明survivin-siRNA可在体外相同培养条件下明显抑制U87细胞的生长，抑制其survivin mRNA的转录，减少其蛋白水平的表达，可能为脑胶质瘤的治疗提供可靠实验室研究资料。
参考文献
[1]Zimmermann TS，Lee AC，Akinc A，et al.RNAi-mediated gene silencing in non-human primates.Nature，2006，441： 111-114
[2]Yang H，Fu JH，Hu Y，et al.Influence of SiRNA targeting survivin on chemosensitivity of H460/cDDP lung cancer cells.J Int Med Res，2008，36： 734-747
[3]Liu Q，Fu H，Xing R，et al.Survivin knockdown combined with apoptin overexpression inhibits cell growth significantly.Cancer Biol Ther.2008，7：1053-1060
[4]Pardridge WM.shRNA and siRNA delivery to the brain.Adv Drug Deliv Rev，2007，59： 141-152
[5]Liu WS，Yan HJ，Qin RY，et al： siRNA directed against survivin enhances pancreatic cancer cell gemcitabine chemosensitivity.Dig Dis Sci，2009，54： 89-96