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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus，HPS)，是猪的一种呼吸道共栖菌，在特定条件下可侵入机体而引起严重的全身性疾病，被称为副猪嗜血杆菌病或革拉泽氏病(Glasser’s Disease)。该病以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征，已经成为影响全球养猪业最为严重的细菌性传染病之一。 近年来，对H.parasuis致病性相关的各毒力因子的研究已经成为热点，但由于H.parasuis的毒力因子十分复杂，加上遗传操作工具的缺乏，各毒力因子的作用机理及毒力因子之间的相互作用关系至今还不清楚，给该病的预防和控制造成了很大的困难。细胞致死性肿胀毒素(cytolethal distending toxin，CDT)是革兰氏阴性菌产生的一种重要的毒力因子，可以引起哺乳动物细胞G1或G2期细胞周期阻滞，使细胞增殖受阻，导致细胞形态呈现特征性的肿胀，最终死亡。该毒素相继在一些消化道致病菌和消化道外的致病菌中检测到。GenBank上H.parasuis SH0165全基因序列中存在CDT基因，但H.parasuis CDT毒素的功能还不清楚。本研究选取本地分离血清4型强毒株SC096为亲本株，利用遗传操作技术分别构建了基因缺失株△CDT1、△CDT2和△CDT1△CDT2，并对其生物学特性进行研究。 为了了解CDT基因在H.parasuis15个参考菌株中情况，我们根据GenBank上SH0165全基因序列，设计两对特异性引物，并通过PCR成功获得了15个参考菌株的CDT基因序列。并对扩增的序列进行测序分析，结果显示：CDT基因在H.parasuis的15个参考菌株中都存在，并且有两个拷贝，每个拷贝CDT基因由CDTC、CDTB和CDTA3个亚基组成，分别表达CDTC、CDTB和CDTA蛋白。15个参考菌株的CDT亚基的相似性都在92％以上，系统进化树分析结果表明CDT基因与毒力，基因型和血清型似乎没有明显的联系。 然后，构建了pHYB-2(PK△CDT1：：KmR)和pHYB-4(PK△CDT2：：EmR)两个自然转化质粒，并利用本实验室已建立的自然转化方法，成功构建了△CDT1、△CDT和△CDT1△CDT23株基因缺失菌株。同时，我们比较了wild-type SC096与△CDT1、△CDT2和△CDT1△CDT2基因缺失菌株在生长特性、抵抗血清中补体杀菌作用、对猪肾上皮细胞(PK-15)和猪脐静脉血管内皮细胞(PUVEC)的黏附入侵能力以及抵抗猪肺泡巨噬纽胞(3D4/2)吞噬能力等方面的变化。在生长特性方面，缺失CDT基因后缺失株的生长速度下降不明显，说明缺失CDT后不影响SC096菌株的生长；在抵抗血清中补体杀菌作用方面，我们用参考菌株Nagasaki，SW114做对照，结果表明在50％和90％的血清中，SC096、Nagasaki的存活率显著的高于SW114，由此可见亲本株SC096株具有高水平的抵抗血清杀菌作用，但是缺失CDT1或CDT2及同时缺失CDT1和CDT2后显著地降低了对猪血清和兔血清的抵抗能力，说明CDT参与了抵抗血清中补体杀菌作用；利用猪肾上皮细胞(PK-15)和猪脐静脉血管内皮细胞(PUVEC)为模型，研究CDT基因在宿主细胞黏附入侵能力方面的作用。与wild-type SC096株相比，当缺失单个CDT基因后，缺失株的粘附入侵能力都显著降低，黏附入侵PK-15细胞和PUVEC细胞的能力分别降低了7～9倍和3～6倍，两个CDT拷贝基因同时缺失后，其粘附入侵PK-15细胞和PUVEC细胞的能力极显著的降低，降低了19～28倍。以上结果说明CDT基因在副猪嗜血杆菌黏附入侵宿主细胞方面发挥了重要作用；利用猪肺泡巨噬细胞(3D4/2)为模型，研究△CDT1、△CDT2缺失株和△CDT1△CDT2双基因缺失菌株抵抗巨噬细胞吞噬能力方面的变化，结果显示，缺失CDT基因后抵抗巨噬细胞吞噬的能力显著下降，特别是两个拷贝同时缺失缺失CDT基因后下降了46～54倍，说明CDT参与了抵抗巨噬细胞吞噬的作用。 最后利用克隆表达技术，成功构建了3个重组质粒pCold-SUMO-CDTA、pCold-SUMO-CDTB和pCold-SUMO-CDTC；将pCold-SUMO-CDTA、pCold-SUMO-CDTB和pCold-SUMO-CDTC转化大肠杆菌BL21(DE)pLysS后用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳检测，结果表明，CDTA、CDTB和CDTC蛋白获得了表达，表达蛋白大小分别为40 kDa、46 kDa和35 kDa。可溶性分析结果表明，3个蛋白都是以包涵体的形式存在，Western-blotting结果显示表达的蛋白具有较好的反应原性。