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维生素B6（Vitamin B6，VB6）是维持机体正常生理代谢活动所必需的重要营养素，其主要的生物活性形式为磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5’-phosphate,PLP），参与体内氨基酸、糖原、神经递质、鞘磷脂、血红素和核酸的合成与代谢。吡哆醛激酶（Pyridoxal kinase,PdxK）和磷酸吡哆醇氧化酶（Pyridoxine5’-phosphate oxidase,PNPO）是PLP的合成酶，在磷酸酶的共同作用下调节着细胞、血浆和组织内PLP的动态平衡。细胞内PLP的缺乏会引起严重的神经系统疾病，而过量的PLP会对机体产生毒性作用，导致运动和感觉神经出现障碍。因此，细胞内PdxK和PNPO的活性必须受到严格调控，以满足新合成的缺辅基酶对PLP的动态需求。 PdxK和PNPO的活性调节可以发生在结构水平上，也可以发生在合成水平上。目前，研究人员已从大肠杆菌、植物、昆虫和哺乳动物中鉴定出PdxK和PNPO，阐明了PdxK和PNPO的晶体结构、活性调节机制和不同底物下的酶动力学特征。蛋白质是基因表达的产物，转录水平的调控是基因表达过程中重要的环节。启动子控制着基因转录的起始和频率，是深入理解基因转录调控机制的关键。人PdxK和PNPO基因已被克隆和鉴定，但对其启动子的研究还未见报道。本研究在生物信息学分析的基础上，克隆和构建人PdxK和PNPO基因不同长度的启动子荧光素酶报告质粒，分析其活性，确定PdxK和PNPO基因的转录调控区域。进一步对转录调控区内潜在的顺式作用元件进行了缺失突变分析，为深入研究PdxK和PNPO基因的转录奠定基础。 1.生物信息学预测结果显示，人PdxK和PNPO基因的转录起始位点分别位于翻译起始位点上游198bp和153bp（标记为+1）；综合启动子预测软件的结果，确定人PdxK和PNPO基因的基本启动子区域为-930～+243和-996～+421，该区域内没有典型的TATA-box和CAAT-box元件，但是在转录起始位点附近含有多拷贝的GC-box和CpG岛； 2.利用Primer Premier5.0设计特异性引物，以人基因组DNA为模板，PCR扩增PdxK和PNPO基因5’端缺失截短片段，连接到含萤火虫荧光素酶基因的pGL3-basic载体上，构建不同长度的启动子-荧光素酶重组质粒。双荧光素酶试验结果表明，人PdxK基因的转录调控区域为-665～-443，缺失该区域将导致启动子的活性降低66％。人PNPO基因的转录调控区域为-996～-851和-412～+85，缺失该区域会导致启动子的活性分别降低25.8%和58.1%。 3.通过JASPAR和Gene Regulation数据库分析PdxK基因-665～-443转录调控区，发现3个潜在的Sp1和1个USF结合位点；而PNPO基因-996～-851和-412～+85的转录调控区发现多个Sp1、E2F1和USF结合位点。设计特异性引物扩增顺式作用元件依次缺失的片段，连接到pGL3-basic载体，构建缺失突变重组质粒。双荧光素酶试验结果显示，PdxK基因转录调控区内的Sp1结合位点（-552～-542）对维持其高转录活性起着重要作用，缺失会导致启动子活性降低61.1%；而PNPO基因转录调控区内E2F1（-867～-857）和USF（-69～-59）结合位点是重要的顺式作用元件，缺失将导致启动子的活性分别降低26.7%和32.5%。