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目的:膜性肾病是引起成人肾病综合征的最常见病因,近年来临床发现膜性肾病患病率有明显上升趋势,其病因尚有待进一步研究。膜性肾病是自身免疫导致的以肾小球上皮细胞下免疫复合物弥漫性沉积,肾小球基底膜增厚伴“钉突”形成为病理特征的一种常见肾炎类型,临床上大多数患者表现为肾病综合征或无症状性蛋白尿。膜性肾病患者血液常处于高凝状态,是导致疾病进展的重要因素。丹参多酚酸盐具有降低血液黏稠度,改善膜性肾病患者的血液高凝状态,改善肾脏微循环以改善肾功能、延缓慢性肾脏疾病进展的作用。本研究通过尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin,C-BSA)的方法建立膜性肾病大鼠模型,并应用丹参多酚酸盐低、中、高剂量进行干预治疗,以盐酸贝那普利作为对照组,通过观察大鼠的24小时尿蛋白定量(24 hours urinary protein quantitation,24h UPQ)、血清总蛋白(Total protein,TP)、白蛋白(Albumin,ALB)、血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(Serum creatinine,Scr)等生化指标以及肾组织CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)、结蛋白(Desmin)的表达,来探讨丹参多酚酸盐对阳离子化牛血清白蛋白致膜性肾病大鼠的治疗作用及机制,从而为临床应用丹参多酚酸盐治疗膜性肾病提供理论依据。方法:选用清洁级健康雄性SD大鼠62只,重180±20g,普通饲料适应性喂养1周后测尿蛋白均为阴性,测24小时尿蛋白定量均小于5mg。随机将其分为正常组10只、造模组52只,给正常组编号。从第二周开始造模组大鼠双前肢腋下及双腹股沟皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的C-BSA,隔日一次,预免疫1周;正常组大鼠相同样部位皮下注射等体积弗氏不完全佐剂乳化的生理盐水,隔日一次,连续1周。第三周开始正式免疫,造模组大鼠尾静脉注射C-BSA,隔日一次,连续免疫4周;正常组大鼠尾静脉注射等量的生理盐水,隔日一次,连续4周。免疫结束后用尿蛋白试纸条测造模组大鼠尿蛋白均为阳性,并随机抽取2只造模大鼠,进行肾组织免疫荧光、光镜、电镜检查,观察到免疫复合物沉积伴基底膜弥漫性增厚,证实膜性肾病造模成功。再按照完全随机法将剩余的造模大鼠随机分为5组,即模型组、盐酸贝那普利组、丹参多酚酸盐低、中、高剂量组,并编号。编号之后代谢笼内留取所有大鼠24小时尿液,检测24小时尿蛋白定量。盐酸贝那普利组按10mg/kg/d给药,用3ml蒸馏水配成混悬液灌胃+生理盐水1.5ml/只腹腔注射;丹参多酚酸盐低、中、高剂量组分别按16.7mg/kg/d、33.3mg/kg/d、66.7mg/kg/d腹腔注射,注射前用1.5ml生理盐水配成溶液+蒸馏水3ml/只灌胃;正常组、模型组均给予蒸馏水3ml/只灌胃+生理盐水1.5ml/只腹腔注射。每天1次,连续4周。各组大鼠自由进食、饮水。连续治疗4周后再次代谢笼内留取各组大鼠24小时尿液,检测24小时尿蛋白定量。之后腹腔注射麻醉,股动脉取血,检测各组大鼠TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr等指标,摘肾留肾组织分别做光镜、电镜、免疫荧光,观察肾小球基底膜、足突及免疫复合物沉积情况;做免疫组化、real-time PCR检测CD2AP及Desmin蛋白在肾组织的表达情况,并用病理图像分析系统进行半定量分析。结果:1 24小时尿蛋白定量连续尾静脉注射C-BSA 4周后,除正常组外,其余各组大鼠均出现大量蛋白尿,与正常组相比均有显著差异(P<0.01)。连续给药4周后,盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组大鼠尿蛋白定量均有明显下降,与模型组相比有明显差异(P<0.01);丹参多酚酸盐各剂量组与盐酸贝那普利组相比差异不明显,无统计学意义(P>0.05);与低剂量丹参多酚酸盐组相比,中高剂量组尿蛋白定量下降更明显,以丹参多酚酸盐高剂量组下降最明显,但无统计学意义(P>0.05)。2各生化指标检测模型组、盐酸贝那普利组、低中高剂量丹参多酚酸盐组与正常组相比,血清TP、ALB均明显降低而TC、TG均明显升高,差异显著(P<0.05);盐酸贝那普利组、低中高剂量丹参多酚酸盐组与模型组相比血清TP、ALB均明显升高而TC、TG均明显降低,差异显著(P<0.05);低中高剂量丹参多酚酸盐组与盐酸贝那普利组相比结果差异不明显,无统计学意义(P>0.05);与低剂量丹参多酚酸盐组相比,中高剂量组血清TP、ALB升高更明显,TC、TG降低更明显,以丹参多酚酸盐高剂量组改变最明显,但无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠血清BUN、Scr比较,结果差异不明显,无统计学意义(P>0.05)。3肾组织病理形态学观察光镜显示:正常组大鼠肾小球形态结构无明显异常,无基底膜增厚;模型组大鼠肾小球基底膜上皮下有明显的嗜复红蛋白沉积,肾小球基底膜弥漫显著增厚,肾小球基底膜外侧“钉突”形成;盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组大鼠肾小球上皮下少量嗜复红蛋白沉积,肾小球基底膜增厚较模型组轻,“钉突”形成亦较模型组少。电镜显示:正常组大鼠肾小球足细胞结构清晰,足突排列整齐;模型组大鼠肾小球基底膜上皮下多数电子致密物沉积、体积较大,足细胞足突广泛融合或消失;盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组大鼠肾小球基底膜上皮下少量电子致密物沉积、体积较小,肾小球基底膜轻度增厚,足细胞足突部分融合。免疫荧光:正常组大鼠肾小球无明显变化,无荧光表现;模型组大鼠可见免疫球蛋白Ig G及补体C3沿毛细血管袢大量分布,荧光强度明显;盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组可见少量Ig G、C3呈颗粒状沿毛细血管袢沉积,且荧光强度较弱。免疫组化:从免疫组化染色中可以看到CD2AP蛋白表达于肾小球上皮下。在正常组大鼠肾小球上大量表达,沿着毛细血管袢呈线样分布,染色最强;在模型组大鼠可见其沿着毛细血管袢呈颗粒样或斑片状分布,染色强度明显减弱,较正常组表达明显减少,有统计学差异(P<0.05);盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组可见其沿着毛细血管袢不连续性线状呈斑片状分布,染色强度明显增强,均较模型组表达明显增多,有统计学意义(P<0.05);丹参多酚酸盐各剂量组与盐酸贝那普利组相比染色强度无明显差异(P>0.05);与低剂量丹参多酚酸盐组相比,中高剂量组染色强度更强,且以高剂量丹参多酚酸盐组染色强度最强,但无统计学差异(P>0.05)。Desmin蛋白主要表达在系膜细胞上,免疫组化染色可见其在正常组大鼠肾小球上微弱表达。与正常组相比,模型组大鼠肾小球内Desmin蛋白在毛细血管壁沿基底膜出现了较强的阳性表达,呈线性分布,Desmin蛋白表达显著增加,有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组阳性染色弱于模型组,Desmin蛋白表达减少,有显著性差异(P<0.05);丹参多酚酸盐各剂量组与盐酸贝那普利组相比染色强度无明显差异(P>0.05);与低剂量丹参多酚酸盐组相比,中高剂量组染色强度更弱,且以高剂量丹参多酚酸盐组染色强度最弱,但无统计学差异(P>0.05)。4肾组织中CD2AP m RNA和Desmin m RNA的表达情况统计学分析结果显示,与正常组相比,模型组CD2AP m RNA的表达明显减少,差异显著(P<0.05);与模型组相比,盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组CD2AP m RNA表达均明显增多,差异显著(P<0.05);丹参多酚酸盐各剂量组与盐酸贝那普利组相比差异不明显(P>0.05);与低剂量丹参多酚酸盐组相比,中高剂量组增多更明显,以丹参多酚酸盐高剂量组增多最明显,但无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比,模型组Desmin m RNA的表达明显增多,差异显著(P<0.05);与模型组相比,盐酸贝那普利组及丹参多酚酸盐各剂量组Desmin m RNA的表达均有所减少,差异显著(P<0.05);丹参多酚酸盐各剂量组与盐酸贝那普利组相比差异不明显(P>0.05);与低剂量丹参多酚酸盐组相比,中高剂量组减少更明显,以丹参多酚酸盐高剂量组减少最明显,但无统计学意义(P>0.05)。结论:1膜性肾病大鼠CD2AP表达减少,Desmin表达增多,并与蛋白尿多少、肾脏病理表现程度变化一致,提示CD2AP和Desmin参与了膜性肾病足细胞的损伤和蛋白尿的产生。2丹参多酚酸盐可以降低膜性肾病大鼠24h尿蛋白定量,升高血清TP、ALB水平,降低TC、TG水平。3丹参多酚酸盐可以有效抑制或减少膜性肾病大鼠肾小球基底膜免疫复合物的沉积及基底膜的增厚,延缓肾病进展。4丹参多酚酸盐可以上调膜性肾病大鼠肾组织CD2AP的表达,下调Desmin的表达,提示丹参多酚酸盐对肾脏的保护作用与维持足细胞正常结构和肾小球滤过膜的完整性有关。