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无论是免疫细胞对病原体的主动吞噬,还是病原体诱导非吞噬细胞的被动吞噬,均是不同细胞膜受体介导的细胞肌动蛋白骨架重排过程,在病原体诱导非吞噬细胞被动吞噬过程中,一些病原体能够诱发非吞噬细胞的吞噬行为从而进入细胞,这使得它们能够穿越组织屏障,逃避免疫攻击。这种诱发的吞噬行为主要有两种方式,都涉及肌动蛋白骨架的重排,一种是“触发机制”（trigger）,病原体在与细胞接触后,直接将毒力因子注入到细胞中引起细胞骨架重排和下游信号转导途径,使病原体进入细胞;另一种是“拉链机制”（zipper-like）,病原体表面蛋白结合并激活细胞表面受体,随后引起细胞骨架重排包裹病原体进入细胞,这一机制的经典模型为单核增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）。李斯特菌是一种食源性条件致病菌,能够引起免疫缺陷人群以及孕妇的严重感染。目前发现有两种细菌表面蛋白介导李斯特菌以“拉链机制”进入宿主细胞:InlA和InlB,InlA能够介导李斯特菌进入某些上皮细胞,而InlB能够介导李斯特菌侵入几乎所有的细胞类型,包括上皮细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等,更重要的是InlB自身足以介导无侵染能力的大肠杆菌或乳胶颗粒内化进入细胞。InlB为分子量67kDa的细菌表面蛋白,其N末端为富含亮氨酸重复序列（LRRs）,其能够结合并激活哺乳动物细胞膜酪氨酸激酶受体Met,激活Rac1、PI3K、Arp2/3复合体、以及丝切蛋白cofilin,引起细胞骨架剧烈重排。磷脂酶D （phospholipase D,PLD）水解细胞膜磷脂的重要组成成分-磷脂酰胆碱生成磷脂酸和胆碱,参与多种细胞生理学现象,包括囊泡运输和细胞骨架重排等。因此,PLD是细胞内重要的信号效应蛋白。在巨噬细胞中,PLD可以与磷酸化的cofilin结合并被激活,同时参与调节抗体受体（FcγR）及补体受体（CR3）介导的免疫细胞的主动吞噬。但PLD在细菌内化侵入非吞噬细胞过程中是否被激活尚未见报道。本研究以李斯特菌侵染非吞噬细胞（Vero）为研究模型,建立细菌侵入非吞噬细胞的模型,通过侵染实验、PLD活性测定、质粒转染、免疫荧光、RNA干扰技术等,对李斯特菌刺激下的Vero细胞内PLD活性变化及其对李斯特菌侵染的影响进行研究。设计了如下三部分研究。第一部分:我们对李斯特菌的生长繁殖周期进行了研究,发现培养8小时后李斯特菌EGD进入对数生长期。同时,对菌浓度与OD600之间的关系进行比较,确定两者之间的关系为EGD-e:y = 30.217x + 6.6787（R2 = 0.9406）以备开展实验。接着,我们以不同感染时间和不同感染比的李斯特菌侵染Vero细胞,结果发现,李斯特菌侵染Vero细胞过程中可以刺激胞内PLD活性的升高,并且随着感染比的升高刺激胞内PLD也呈显著上升趋势;随着感染时间的延长激活胞内PLD活性也随之升高,但在60min～90min时,胞内PLD活性趋于稳定。因此,我们确定了感染参数（感染比100:1;感染时间30min）。接着我们用带有FITC标记的PLD抗体和TRITC-phalloidin对胞内PLD与肌动蛋白进行荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察。结果发现PLD1主要存在于胞质中,和肌动蛋白之间基本不存在非常明显的共定位现象,而PLD2主要分布与细胞膜上,和肌动蛋白之间具有较为明显的共定位。第二部分:通过研究我们发现PLD在李斯特菌的侵染过程中确有PLD的激活,那么其具体功能如何呢?本部分首先通过PLD国际公认的化学抑制剂1-丁醇预处理Vero细胞,发现随着1-丁醇浓度的升高,李斯特菌的侵染量也有明显的下降。考虑到1-丁醇对PLD的非特异性,因此我们又通过RNAi技术使胞内PLD表达量下降,观察李斯特菌的侵染效率,结果发现,无论是PLD1还是PLD2干扰都会降低李斯特菌的侵染能力。既然PLD活性下降可以降低李斯特菌的侵染效率,那么我们顺其自然的想到升高其活性又会如何。接着我们通过向细胞感染腺病毒和转染PLD质粒,使胞内PLD基因过表达。结果发现胞内PLD活性升高同样也会影响李斯特菌侵染能力。因此,我们认为胞内PLD活性的上升和下降对于李斯特菌侵染都是不利的,这种现象可能与细胞内信号转导的精密调控有关,但具体机制有待进一步探讨。第三部分:通过第一部分我们已经证实了李斯特菌内化侵入能够激活宿主PLD活性,那么这种激活是否与李斯特菌的侵袭蛋白有关。因此,我们以不同缺陷性李斯特菌（EGD、△InlA、△InlB、△InlAB）侵染Vero细胞,结果发现内化素缺陷可以明显降低李斯特菌侵染的能力,内化素B缺陷尤其明显,并且用不同缺陷型李斯特菌刺激Vero细胞,测定Vero细胞的PLD活性,发现李斯特菌不同缺陷型均可以明显刺激宿主细胞PLD活性升高,但是内化素B缺失时（△InlB、△InlAB）,李斯特菌诱导的胞内PLD活性也明显的降低。这就提示了我们内化素B在侵染过程中起着不可替代的作用,其可能是激活PLD的重要因子。这将为日后的研究奠定了基础。另外,我们在实验中意外的发现胎牛血清对李斯特菌侵染有很大的影响,并且这样的影响对不同缺陷型菌株都是一致的。但具体机制还不清楚。通过对上述三部分的研究,我们阐明当李斯特菌侵染非吞噬细胞过程中,胞内PLD确有激活。进而,我们通过PLD化学抑制剂、RNAi和转染质粒来调控胞内PLD的表达证明PLD在细菌侵染过程中的作用。发现无论PLD受抑制还是过表达都是不利与细菌侵入的。接着,我们用不同缺陷型李斯特菌刺激宿主细胞,发现内化素B缺陷对李斯特菌的侵染效率和激活胞内PLD活性均较大影响。这提示我们PLD可能参与InlB介导受体信号通路的。这将有助于深入了解李斯特菌侵染宿主细胞过程的细节,以及为进一步阐明病原体与宿主细胞相互作用的复杂方式提供理论基础。