绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),属假单胞菌属(Pseudomonas),广泛存在于水、空气、土壤及动物和人的皮肤、消化道、呼吸道、尿道和肠道中,是一种条件致病菌,在特定的合适条件下能引起人和动物的感染发病。绿脓杆菌目前已成为危害人类健康及养殖业发展的重要疫病,其生物毒性主要是通过级联式的群体感应系统Quorum sensing system,QS)介导的。群体感应系统是一个依赖于细菌细胞数量的基因调控系统,在绿脓杆菌中分别表现为las、rhl以及pqs系统,其中las系统位于级联反应的顶端。低磷酸盐离子浓度条件下的绿脓杆菌,利用IQS系统,在低磷响应的转录激活因子Pho B的调控下,越过las系统,激活rhl以及pqs系统,表现生物毒性。在临床上,磷酸耗竭(phosphate depletion)是外科手术病人常见状况,此逆境条件常常导致包括绿脓杆菌引起的多种细菌病害的加重加剧,甚至导致死亡。我们通过HPLC和LC-MS的方法,分析高磷和低磷培养条件下的生物发酵液中信号变化趋势,进一步确定了环境中无机磷酸盐离子对绿脓杆菌群体感应系统的影响。为进一步阐明IQS调控机理及信号通路,我们利用转录组高通量测序的手段,确定了两个转录调控基因PA3045和PA2665。PA3045在HP-Las R和HP-PAO1比对,表达量显著的下调,下调倍数2.02,是双组分系统中的效应器,对应的感受器是PA3044;PA2665在LP-Pho B与HP-PhoB比对,表达量显著的上调,上调倍数2.07,是一种厌氧一氧化氮还原酶的转录调控因子。PA2665位于黄素血红蛋白基因上游,能调控其启动子中感受NO变化区域,从而调控黄素血红蛋白基因表达。对双组分系统PA3044、PA3045以及PA2665进行基因敲除和互补试验,发现PA3044对群体感应基因调控无显著影响。PA3045、PA2665敲除,对比野生型,生物膜产量增强,弹性蛋白酶产量增加,AHL信号产量增强,绿脓菌素产量也有一定程度增加,在运动性方面,swimming无影响,swarming相较于野生型增强,半径增大。这表明PA3045、PA2665均为负调控因子,能够影响绿脓杆菌诸多毒力因子表达,如生物膜、弹性蛋白酶、运动性等。由于日渐增多的抗菌药物的使用,病菌多重耐药、菌群失调等多种负面应用不断产生,细菌对抗菌药物耐药性的迅速增加已严重威胁到人类健康,多重耐药菌株的出现显著增加了患者的病死率和医疗费用,影响医疗质量。绿脓杆菌中的多种毒力因子表达及生物膜的形成都受到群体感应系统调控,研究绿脓杆菌群体感应系统,探明调控机理。通过干扰群体感应信号通路,使病原菌无法对抗宿主免疫防御系统,易于被宿主机体自身清除。这为研制新的治疗绿脓杆菌感染药物带来新的思路。本文从DNA水平验证PA3045、PA2665调控作用,为进一步找寻其信号通路,完善绿脓杆菌群体感应通讯系统打下基础。