【摘 要】
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目的:本实验为了探讨了奇壬醇对RANKL诱导破骨细胞前体向破骨细胞分化的影响及机制,首先建立了破骨细胞模型,然后检测了破骨细胞的细胞增殖活性,通过TRAP染色以及鬼笔环肽染色来证实破骨细胞,另外通过Western blotting和PCR技术检测了破骨细胞形成相关基因及蛋白的表达,为奇壬醇防治骨质疏松症提供理论依据。方法:1.通过RAW264.7细胞系(第2代,购自ATCC,美国)建立破骨细胞诱导
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目的:本实验为了探讨了奇壬醇对RANKL诱导破骨细胞前体向破骨细胞分化的影响及机制,首先建立了破骨细胞模型,然后检测了破骨细胞的细胞增殖活性,通过TRAP染色以及鬼笔环肽染色来证实破骨细胞,另外通过Western blotting和PCR技术检测了破骨细胞形成相关基因及蛋白的表达,为奇壬醇防治骨质疏松症提供理论依据。方法:1.通过RAW264.7细胞系（第2代,购自ATCC,美国）建立破骨细胞诱导培养体系:选取RAW264.7细胞用DMEN培养基复苏、培养、传代,选取α-MEM培养基,实现定向分化,且培养基里面包含重组RANKL35ng/ml;2.选择合适的溶液对破骨细胞进行检测,因此采用了抗酒石酸酸性磷酸酶染色,并用细胞活性测定实验法（cck-8）检测不同浓度下的奇壬醇破骨细胞前体及破骨细胞的毒性作用;3.利用PCR技术完成检测工作,选择浓度不一的奇壬醇对破骨细胞分化相关基因AP-1、MMP表达的影响;4.采用Western blotting技术检测不同浓度的奇壬醇对破骨细胞分化相关蛋白AP-1、MMP表达的影响;5.利用Corning骨检测微孔板,根据细胞骨架肌动蛋白环的相关,选择浓度不一的几组奇壬醇溶液,探讨破骨细胞骨吸收效果;6.统计学分析使用的是SPSS 23.0软件,通过Mann-Whitney’s U检验,分析实验对象的统计学特征。所有实验至少重复三次,并得到相似的结果。结果:1.实验成功建立了RAW264.7细胞系诱导的破骨细胞模型。2.与对照组相比,实验组加入不同浓度的奇壬醇（20μM、40μM、60μM）,对两种类型的细胞展开毒性检测,发现不具备毒性功能,其中一个是破骨细胞,一个则是破骨细胞前体细胞。与对照组相比,使用了奇壬醇后,破骨细胞的生成数量得以降低,因此两者之间存在统计学差异,破骨细胞的分化受到了奇壬醇的影响,当浓度最高,抑制作用就越加显著;2.在骨检测微孔板实验后,根据实验结果可知,使用了奇壬醇后,凹坑面积与对照组相比,得到了降低,因此两者之间存在统计学差异,伴随奇壬醇浓度的提升,骨凹坑面积越小,另一种实验结果也与这个现象具有较高的相似度,就是肌动蛋白环实验;3.本研究AP-1及MMPm RNA表达水平在奇壬醇刺激破骨细胞后,与对照组在活性的比较上,处于降低水平,其中在12、24、48小时,不同时间段的持续观察发现,组间对比存在统计学差异,且具有显著特征。同时,通过蛋白质印迹分析,奇壬醇可以降低RANKL介导的AP-1及MMP蛋白的表达,这一结果得到了验证。结论:奇壬醇能够有效的抑制体外破骨细胞的分化,其主要的原理是因为其能够针对JNK信号的传导途径进行抑制,从而使破骨细胞停止继续产生分化。AP-1及MMP的活性表达,从而抑制相关蛋白的生成。我们的结果表明,奇壬醇以剂量依赖性的方式抑制破骨细胞的分化,为骨质疏松疾病的预防及治疗提供了理论依据,给骨质疏松的治疗提供了一个潜在药物。
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