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牦牛的遗传改良在我国具有悠久的历史，最早可追溯到1000多年前，藏族人民利用种间杂交来进行改良，以提高后代乳肉生产性能。上世纪90年代初，我国开始尝试用一代黄改公牛改良牦牛，即“新三元杂交”，该方法操作简便、改良效果好、成本低、杂种优势强，但是F1代犏牛雄性不育，这成为牦牛遗传改良的一大难题。本研究以健康成年黄牛、牦牛和犏牛为研究对象，利用PCR扩增的方法获取了黄牛以及牦牛Piwi蛋白家族Piwil1、Piwil2编码区的基因序列。利用荧光定量PCR的方法检测了Piwil1、Piwil2基因在黄牛及犏牛睾丸组织中的表达差异，利用亚硫酸氢盐测序的方法检测了这两个基因5调控区甲基化状态，再结合转座子Line-1的表达水平以及DNA甲基化状况，来探讨Piwi蛋白参与的Piwi通路与犏牛雄性不育的关系.最后，利用甲基化芯片的方法检测了黄牛以及犏牛基因组DNA的甲基化状况，为研究犏牛雄性不育与DNA甲基化的关系提供理论依据。
1.黄牛、牦牛Piwil1、Piwil2基因分子克隆、序列分析以及在黄牛和犏牛中mRNA表达、甲基化差异分析
本实验以黄牛和牦牛睾丸组织总RNA为模板，分别用所设计的3对扩增引物对Piwil1以及Piwil2基因编码区进行PCR扩增，测序后通过ContigExpress软件进行序列拼接，获得了黄牛和牦牛Piwil1、Piwil2基因完整的编码区序列，长度各为2586bp和2910 bp，分别编码861和969个氨基酸。Piwil1蛋白和Piwil2蛋白在氨基酸序列和蛋白质结构上具有保守性，均含有PAZ和PIWI这两个保守的结构域，其中PAZ结构域具有与核苷酸相结合的功能;PIWI结构域又包含两个亚结构域，一个是与RNA的5端定位相关的结构域，另一个是含有RNA酶切活性的DDH(Asp-Asp-His)结构域。这些结构域表明Piwil1和Piwil2蛋白的功能与RNA有密切的关联.
以黄牛肌肉、血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、卵巢、附睾、睾丸组织总RNA为模板，利用设计的Piwil1、Piwil2和β-actin基因的定量引物对黄牛Piwil1、Piwil2基因的表达进行检测，结果表明Piwil1、Piwil2基因在睾丸组织中特异表达，
用Real-time PCR法对黄牛和犏牛睾丸组织Piwil1、Piwil2和β-actin基因mRNA表达量进行分析发现，Piwil1和Piwil2基因在黄牛睾丸组织中的表达量均极显著高于犏牛睾丸组织中的表达(P＜0.01)。
在Piwil1以及Piwil2基因5端侧翼的CpG岛区域内设计BSP引物，以亚硫酸氢钠处理后的黄牛、犏牛睾丸组织基因组DNA为模板进行扩增。测序后发现Piwil1的BSP扩增产物包含26个CpG位点，覆盖ADR1、HSF、cap、NF-E2等多个转录因子结合部位.甲基化检测结果显示，在被检测的Piwil1基因CpG位点中，黄牛睾丸组织中甲基化的CpG位点占26.60％，犏牛的为91.20％，犏牛的甲基化水平极显著高于黄牛(P＜0.01).Piwil2的BSP扩增产物包含19个CpG位点，覆盖Nkx-2、cap、GCR1、MZF1、HSF、ADR1、MyoD等转录因子结合部位.在被检测的Piwil2基因CpG位点中，黄牛睾丸甲基化的CpG位点占59.50％，犏牛为95.80％，犏牛的甲基化水平极显著高于黄牛(P＜0.01)。说明Piwil1、Piwil2基因5侧翼的甲基化状态发生变化分别对Piwil1、Piwil2基因的表达起调控作用，可能与犏牛精子发生障碍、雄性不育有关。
2.犏牛Line-1转座子基因分子克隆、序列分析以及在黄牛和犏牛中mRNA表达、甲基化差异分析
本实验以犏牛睾丸组织总RNA为模板，利用ORF1、ORF2扩增引物分别进行RT-PCR扩增，测序后用ContigExpress软件进行序列拼接，获得了一段5221 bp的犏牛Line-1转座子基因序列，包括部分的5和3端序列以及完整的ORF1和ORF2序列。ORF1蛋白编码308个氨基酸残基，为一个典型的转座元件成份，不合有特殊的结构域，具有核苷酸绑定的功能;ORF2蛋白编码1272个氨基酸残基，含有L1-EN和RT_like这两个保守的结构域.其中，L1-EN结构域包含228个氨基酸残基，从第9位氨基酸到第236位，具有核酸内切酶的功能，RT_like结构域共有263个氨基酸残基，位于510位到772位氨基酸之间，具有反转录转座的功能。这说明Line-1转座子在犏牛睾丸组织当中具有反转录转座的活性。
对黄牛和犏牛睾丸组织β-actin和Line-1基因mRNA表达量分析发现，犏牛Line-1转座子的mRNA相对表达量显著高于黄牛睾丸组织中的表达量(P＜0.05)。这表明Line-1转座子沉默机制在犏牛当中发生异常，L1转座子表达不受抑制，这可能F1代犏牛雄性不育有关。
在Line-1基因的内部启动子下游的CpG岛内设计BSP引物，以亚硫酸氢钠处理后的黄牛、犏牛睾丸组织基因组DNA为模板进行扩增。BSP扩增产物均为310bp，包含18个CpG位点，覆盖GATA-1、cap、E2F、MZF1、HSF、ADR1、MyoD等多个转录因子结合部位。甲基化检测结果显示，在被检测的Line-1基因CpG位点中，黄牛睾丸甲基化的占84.40％，犏牛的为90.00％，两者的甲基化水平无显著差异(P＞0.05)。说明L1转座子的去阻遏并不是由于去甲基化造成的，而是在其他的调控途径中出现了问题，结合上一章，推测转座子的高表达与Piwil1以及Piwil2基因的表达下调相关。
3.黄牛、犏牛基因组甲基化芯片分析
本实验利用6头黄牛、6头犏牛的睾丸组织DNA进行甲基化芯片分析，发现在黄牛以及犏牛睾丸组织中发现了17006个甲基化区域，其中黄牛甲基化区域为8428个占49.56％，犏牛甲基化区域为8578个占50.44％，甲基化差异区域有969个，这说明黄牛与犏牛基因组整体水平上甲基化差异不显著，但是部分基因之间存在较大的差异。甲基化差异基因涉及多种生物学途径以及信号通路，其中与精子发生关系较为密切的有MAPK、Wnt和GnRH信号通路以及端粒酶逆转录酶（TERT）的生物学功能。MAPK9、GADD45A、CCND2、CAMK2B和TERT为这几个通路的关键基因，芯片结果表明这几个基因的启动子区在犏牛睾丸组织中均处于高甲基化状态，推测可能与犏牛精子发生障碍，雄性不育相关。