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研究背景: 白血病是小儿恶性肿瘤中发病率最高的一种，虽然大多儿童的急性白血病能通过化疗治愈，但耐药及治疗相关毒性仍是其治疗中面临的重要挑战。近年来，靶向肿瘤微环境的辅助化疗逐渐成为肿瘤领域研究的热点。 在过去十年的研究中，人们发现在造血微环境中骨髓造血干细胞和周边细胞的相互作用及影响，造血细胞的生长由骨髓基质细胞通过产生细胞因子、趋化因子和由细胞黏附为起点的细胞内信号紧密调节。造血微环境在骨髓腔中定位于“干细胞龛”，后者是造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)聚集的地方，包括成骨细胞(骨内膜)龛和血管龛，分别给促成造血的长期HSC及周期活跃的短期HSC提供一个微环境，协同调节HSC的自我更新、增殖、分化和在骨髓内外的移动。骨髓微环境中特殊的“龛”为肿瘤细胞提供一个逃避化疗毒性凋亡的居所并获得耐药表型。 作为骨髓微环境中的重要成员，MSC是存在于血窦表面并促成窦壁结构产生的自我更新的祖细胞，产生血管生成素-1并能产生成骨细胞，形成骨内膜龛。MSC产生功能不同的细胞(成骨细胞和脂肪细胞)，形成不同的结构(骨表面和窦壁)，是组成造血微环境的关键成分，在支持造血中扮演一个重要的角色。MSC还是一种具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，其重要特点是能够逃避免疫识别、抑制免疫反应，也因此成功的被应用于临床上许多疾病的治疗中，如移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、心肌梗死及神经系统疾病等。但与此同时，它在多种肿瘤体系中被证明能通过多种粘附和非粘附机制及其多重信号通路引起肿瘤耐药。 血液恶性肿瘤病人的化疗后HSC和MSC共移植研究表明，同时植入MSC和HSC的病人，比起只植入HSC的病人有更高的复发率。这种复发率的升高，不能排除与MSC导致的耐药有一定的相关性，有待进一步研究证明。而在体内实验中，发现MSC和肿瘤细胞混合注射的小鼠平均肿瘤容量大，也提示了MSC对肿瘤的促进作用。 尽管MSC在骨髓中的数量不多，但MSC及其衍生的基质细胞分泌的可溶性因子通过旁分泌作用在骨髓龛中直接作用于肿瘤细胞。其中，MSC分泌的细胞因子白介素-6(IL-6)在当中扮演着重要角色。MSC通过可溶性因子IL-6介导的耐药涉及黏附依赖性机制及非黏附依赖性机制及多重信号通路，这些信号传导途径通过调节Bcl-2等基因的表达，促进细胞生长、分化和抗凋亡。 此外，以环氧化酶2(Cycloxygenase，COX-2)为关键酶的前列腺素E2在MSC介导的耐药中也有重要作用。COX-2通过抑制神经鞘磷脂酶的活性和神经酰胺的产生，及调节抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、Akt通路活化及细胞对NO的易感性，从而对抗凋亡。依托考昔作为改良后的COX-2抑制剂，在肿瘤的防治中可能仍有很大发展空间。 实验目的： 1．了解急性白血病患儿骨髓上清及间充质干细胞培养上清的IL-6水平，探讨其临床意义。 2．探索间充质干细胞分泌的可溶性因子通过非粘附介导的机制对Jurkat、K562、K562/A02等白血病细胞株在细胞毒性药物处理下的保护作用。 3．探讨COX-2抑制剂依托考昔对MSC的可溶性因子介导耐药的干预作用。 实验方法： 1．从骨髓中分离单个核细胞，体外培养间充质干细胞，制备间充质干细胞条件培养基。 2．用流式细胞仪鉴定MSC表面CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR抗原。 3．酶联免疫法检测非白血病和白血病儿童骨髓上清及骨髓分离培养的MSC培养液中IL-6的含量。 4． MSC条件培养基作用于白血病细胞株Jurkat、K562及K562/AO2，流式细胞仪检测多柔比星诱导的白血病细胞株的凋亡率，检测白血病细胞株的细胞周期。 5．荧光定量PCR检测Bcl-2、Mcl-1、COX-2基因表达量。 6．改良 MTT法检测细胞株在多柔比星、柔红霉素、长春新碱、阿糖胞苷、门冬酰胺酶、地塞米松等化疗药物诱导下的药物抑制曲线及依托考昔干预下的药物抑制曲线。 7．用COX-2抑制剂依托考昔干预，检测多柔比星诱导下白血病细胞株凋亡率及细胞周期，和Bcl-2、Mcl-1、COX-2基因表达量。 实验结果： 1. MSC阳性表达CD90、CD105、CD73,而CD34、CD45、HLA-DR、CD14、CD19、CD79a、CD11b则呈阴性。 2.所有检测对象中不同性别间、不同年龄间儿童骨髓上清IL-6水平的差别无显著意义；非白血病患儿与处于完全缓解期的白血病患儿骨髓 IL-6水平的差别无显著意义；初诊及骨髓未缓解的白血病患儿骨髓上清 IL-6水平明显高于非白血病组及化疗后处于完全缓解期的白血病患儿组（P＜0.05）；初诊及骨髓未缓解白血病患儿中急性髓细胞白血病患儿骨髓 IL-6水平高于急性淋巴细胞白血病患儿（P＜0.05）。处于完全缓解期的不同类型白血病患儿骨髓IL-6水平差别无统计学意义，按白血病诊疗建议中分类的低、中、高危患儿 IL-6水平差别均无统计学意义。 3.白血病患儿与非白血病患儿 MSC条件培养基中 IL-6水平差别无统计学意义；所有检测对象不同性别、年龄及白血病类型之间的MSC条件培养基中IL-6水平的差别无统计学意义。急性淋巴细胞白血病患儿中，中高危患儿MSC条件培养基中IL-6水平比低危患儿稍高，但差别无统计学意义（P＞0.05）。 4. Jurkat、K562及K562/AO2细胞株的MSC条件培养基组加多柔比星诱导凋亡后，细胞存活率高于只加多柔比星的对照组（P＜0.05）；加 MSC条件培养基后，三种白血病细胞株的细胞周期均出现阻滞，G0-G1期细胞比例增加（P＜0.05）； 5. MSC条件培养基能上调Jurkat、K562及K562/AO2白血病细胞株Bcl-2基因的表达（P＜0.05），上调K562/AO2的COX-2基因表达（P＜0.05）； 6. Jurkat细胞株、K562细胞株及K562/AO2细胞株单独加依托考昔时，均未出现生长抑制，Jurkat细胞株联用依托考昔及多柔比星、柔红霉素、长春新碱或门冬酰胺时，均比化疗药单独使用时抑制率提高（Q≥1.15）；联用依托考昔及地塞米松时抑制率降低，表现出拮抗作用（Q＜0.85）； K562细胞株联用依托考昔及阿糖胞苷、多柔比星或柔红霉素时，表现出协同作用（Q≥1.15）； K562/AO2细胞株联用依托考昔及多柔比星时，表现出协同作用（Q≥1.15）。 7.白血病细胞株加依托考昔不能增加凋亡，能使多柔比星诱导的凋亡及坏死增多。单独加依托考昔后白血病细胞株的细胞周期与对照组差别无统计学意义；加MSC条件培养基再加依托考昔干预组，S期及 G2-M期的细胞比例增加。K562/AO2细胞株加依托考昔后COX-2基因的表达轻微下调（P＞0.05），依托考昔对Mcl-1及Bcl-2的表达差别无统计学意义。 结论： 1.急性白血病患儿的骨髓 IL-6异常升高，可能与其白血病类型及肿瘤负荷有关；其骨髓分离培养的MSC能分泌IL-6。 2. MSC通过非细胞粘附机制不能上调Jurkat、K562、K562/AO2细胞株Mcl-1基因的表达，能上调三种细胞株 Bcl-2基因的表达，上调K562/AO2的COX-2基因表达，Jurkat及K562细胞株COX-2基因表达无明显上调。 3. COX-2特异性抑制剂依托考昔，不能诱导白血病细胞发生凋亡，不能明显改变白血病细胞周期，但在体外化疗药物作用于白血病细胞株时，加依托考昔表现增效作用，并能逆转MSC条件培养基引起的周期停滞。COX-2可能在MSC通过可溶性因子介导细胞周期停滞的机制中有重要作用，白血病细胞周期的抑制可被COX-2抑制剂部分逆转。